白喉毒素突变体CRM197在大肠杆菌中优化表达及人群血清抗体水平分析

目的 构建白喉毒素突变体CRM197的原核表达载体,在大肠杆菌中表达CRM197蛋白。分析健康人群血清中的CRM197抗体水平。方法 对CRM197基因进行大肠杆菌密码子优化并克隆至pET28a(+)中,经表达条件优化后采用镍柱亲和层析和离子交换层析对重组蛋白CRM197进行纯化,对纯化的CRM197进行Western blot鉴定。最后,经纯化后的CRM197蛋白与健康人群血清进行反应,检测人群血清中针对该蛋白的抗体水平。结果 CRM197蛋白进行了密码子及表达条件优化后,获得了可溶性表达蛋白。经镍柱亲和层析和离子交换层析后其纯度可达95%以上,Western Blot鉴定后能得到单一的特异性条带。经纯化的CRM197蛋白与不同年龄阶段健康人群血清均发生不同程度的抗原抗体反应。结论 利用本研究的策略,CRM197得到高效的可溶性表达,但人群血清中含有高水平的CRM197抗体,这些抗体的存在可能会影响到应用CRM197结合多糖作为抗原进行特异免疫效果的评价以及作为诊断抗原的应用。

空肠弯曲菌琼脂稀释法和E-test法抗生素敏感性检测结果差异分析

目的利用琼脂稀释法和E-test法检测空肠弯曲菌对10种常用抗生素的敏感性,并对检测结果进行比较,为空肠弯曲菌抗生素敏感性检测方法的确定及检测结果的分析提供科学依据。方法应用世界卫生组织(WHO)全球食源性病原菌感染网络(GFN)推荐的弯曲菌的琼脂稀释法与E-test法同时测定100株空肠弯曲菌对10种抗生素最小抑菌浓度(mini-mum inhibitory concentration,MIC)。结果应用相同的判断标准,100株细菌使用琼脂稀释法获得甲硝唑、左氧氟沙星、链霉素、庆大霉素、环丙沙星、四环素、红霉素、氯霉素、氨苄青霉素以及萘啶酸的耐药率分别为:91%、51%、6%、6%、81%、84%、0、12%,、38%、86%。而E-test法的耐药率分别为:84%、57%、5%、7%、84%、86%、0、11%,、45%、87%。配对卡方检验分析结果显示,除甲硝唑及氨苄青霉素外,其余8种抗生素两种检测方法获得针对抗生素的耐药率没有显著差异。针对每种抗生素,E-test法获得的MIC50和MIC90值均高于琼脂稀释法。两种方法获得的MIC值的一致率硝唑最低,为71%。结论使用琼脂稀释法以及E-test法均得到:大于80%的空肠弯曲菌对萘啶酸、甲硝唑、环丙沙星以及四环素的耐药;红霉素、庆大霉素以及链霉素对其生长仍然有较强的抑制作用。E-test法分析空肠弯曲菌对甲硝唑及氨苄青霉素的MIC值及判断耐药结果时,应结合使用琼脂稀释法。

空肠弯曲菌喹诺酮类抗生素敏感性检测及其耐药机理分析

目的了解我国不同宿主来源空肠弯曲菌对喹诺酮及氟喹诺酮类抗生素的耐药现状,分析耐药菌株的耐药机制。方法利用96孔琼脂稀释法分析不同来源空肠弯曲菌对萘啶酸、环丙沙星两种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。对102株检测耐药的菌株和27株敏感菌株通过基因测序的方法分析其耐药机制。结果234株空肠弯曲菌中共筛查到218株(93.16%)萘啶酸耐药菌株,其中鸡粪和鸭粪来源菌株耐药率均为100.00%,腹泻病人粪便来源菌株耐药率是97.96%,食品动物来源菌株耐药率是97.83%,牛粪来源菌株耐药率是77.97%,耐药率差异有统计学意义(P<0.05),鸡粪和鸭粪来源菌株耐药率最高;211株(90.17%)环丙沙星耐药菌株,其中鸡粪和鸭粪来源菌株耐药率均为100%,腹泻病人粪便来源菌株耐药率是91.84%,食品动物来源菌株耐药率是95.65%,牛粪来源菌株耐药率是77.97%,耐药率差异有统计学意义(P<0.05),鸡粪和鸭粪来源菌株耐药率最高。所有的耐药菌株gyrA基因的喹诺酮类耐药决定区(QRDR)都存在Thr-86-Ile点突变。gyrB基因相关区域测序显示不存在有意义突变。结论我国分离空肠弯曲菌菌株对萘啶酸、环丙沙星耐药严重,gyrA基因QRDR内的Thr-86-Ile突变能引起空肠弯曲菌对喹诺酮类及氟喹诺酮类抗生素高水平耐药。

结肠弯曲菌Real-time PCR检测方法的建立

目的建立结肠弯曲菌实时PCR检测方法并评价该方法的可行性。方法BLAST与Vector NTI Suite 6.0筛选出结肠弯曲菌的特异基因ceuE作为检测靶基因,Primer 5.0和Oligo6.0设计引物和探针,优化实时PCR反应体系并评价其最低检测限、特异性、可重复性。结果与结论在结肠弯曲菌的ceuE特异基因上设计引物和探针,经优化了的实时PCR反应体系最低检测限为5.62CFU,特异度为100%,变异系数为0.15%～1.30%,本研究为结肠弯曲菌的快速检测提供了一种参考方法。

68株急性肾小球肾炎暴发相关A组链球菌耐药性分析

目的对贵州两县急性肾小球肾炎暴发相关A组链球菌(group A streptococcus,GAS)进行抗生素耐药性分析,探讨耐药监测在GAS疫情处理与控制中的作用。方法采用E-test法测定GAS对8种抗生素(氨苄青霉素、头孢曲松、万古霉素、红霉素、四环素、左氧氟沙星、氯霉素、克林霉素)的敏感性。结果68株GAS对红霉素和四环素的耐药率分别为88.2%和97.1%。不同人群、不同学校来源菌株对抗生素的敏感性无统计学差异(P>0.05)。结论健康携带者与患者分离菌株间抗生素耐药性的一致性提示对自然人携带GAS的耐药监测对疾病控制与疫情处理的重要性;当地治疗GAS感染不宜使用红霉素,青霉素仍为治疗GAS感染的首选药物,对青霉素过敏者可选头孢菌素类抗生素替代。

空肠弯曲菌外膜蛋白rOMP18的克隆表达及抗原性分析

目的构建空肠弯曲菌omp18基因的重组表达质粒、克隆表达rOMP18重组蛋白、对表达产物进行鉴定并评价其抗原性。方法 PCR扩增空肠弯曲菌的omp18基因片段,将其连接到表达载体pET32a(+)中并转化至大肠杆菌(E.co-liBL21(DE3)),诱导表达后SDS-PAGE分析其表达产物并纯化目的蛋白。应用空肠弯曲菌感染免疫血清,利用Western-blot方法分析其抗原性。结果与结论单、双酶鉴定结果显示已成功构建rOMP18的重组表达载体pET32a-omp18,IPTG诱导表达产物的相对分子质量与理论相符34kD(HIS16kD)。Western-blot检测结果表明重组蛋白rOMP18具有抗原性,为空肠弯曲菌感染的特异抗体的检测提供候选抗原。

人不同程度疲劳状态唾液蛋白标志物的肽谱研究

目的利用目前比较成熟的唾液飞行时间质谱分析技术探索疲劳状态与非疲劳状态下有差异的大分子量肽段,为研究疲劳更加便捷稳定的标志物提供重要的理论基础。方法采集10名健康志愿者唾液样本,采用磁珠富集(MB)和原液直接检测两种样品处理方式进行飞行时间质谱分析,以MB的唾液质谱和离心后直接取上清液(原液)的唾液质谱建模。结果磁珠和直接采样均在2000~15000 Da具有很好的谱图,富集会丢失部分峰。每个人早、晚的谱图均有差异,由于样本份数有限,暂未行交叉验证,因此每个样本采两张谱图,早晚各用20张谱图进行建模分析:在原液样本两组间发现3个差异肽。MB模型的交叉效度为92.06%,原液模型的交叉效度为95.49%。结论人不同程度疲劳状态唾液蛋白标志物的肽谱在分子量2000~15000 Da范围内有差异峰,为进一步实现基于生物传感器技术等的便捷疲劳检测方法提供科学依据,具有重要的理论和现实意义。

幽门螺杆菌26695及其不同克拉霉素耐药水平衍生株的比较蛋白质组学分析

背景:目前克拉霉素耐药机制的研究主要集中于对幽门螺杆菌(H.pylori)23S rRNA基因的分析,其他基因与克拉霉素耐药的关系在国内外尚未见报道。目的:应用蛋白质组学技术分析不同克拉霉素浓度下耐药H.pylori菌株的发生机制,以期发现新的克拉霉素耐药相关基因。方法:以H.pylori 26695为出发菌株,在含克拉霉素平皿上选择耐药突变体,提取全菌蛋白后通过双向凝胶电泳(2-DE)分离蛋白,银染后应用Image Master 2D Elite软件比较不同浓度克拉霉素耐药株和野生株的蛋白表达差异,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定,并在NCBI的H.pylori蛋白数据库中搜索理论上酶解肽段能与之相匹配的蛋白。结果:共10个蛋白点在耐药株与野生株以及不同浓度耐药株间有明显差异,其中3个蛋白点为DNA指导的RNA多聚酶α亚单位,其表达量和等电点在耐药株与野生株间存在明显差异;1个蛋白点为黄素氧化还原蛋白,其在耐药株中的表达量上调;2个蛋白点为30S核糖体蛋白S1,其在耐药株中的表达量下调;3个蛋白点为过氧化氢酶,其在耐药株中的表达量上调;1个蛋白点为细胞分裂抑制剂,其在低浓度克拉霉素耐药株中的表达量较野生株上调,而在高浓度克拉霉素耐药株中的表达量较野生株下调。结论:不同浓度克拉霉素耐药株的耐药机制有不同的相关靶点,为研究H.pylori 23S rRNA以外克拉霉素的耐药机制提供了线索。

C群脑膜炎奈瑟菌部分蛋白表型特征分析

目的以蛋白质组学研究为基础,分析2003～2005年间我国流脑暴发流行期间C群脑膜炎奈瑟菌菌株分布特征。方法利用双向电泳技术获得66株2003～2005年流脑流行期内分离的C群脑膜炎奈瑟菌菌株及2株参考菌株的2-DE电泳图谱,并结合质谱分析的结果进行部分外膜蛋白和sucD蛋白表型分析。结果根据外膜蛋白和sucD蛋白将实验菌株共分为9型,其中安徽菌株分型结果显示出了高度的一致性,而其他地区菌株分型分布则显示出高度的多态性。结论安徽已经有优势菌型形成,但优势菌型还没在全国范围内出现,此类菌型分布和变迁的检测可能对认识流脑的流行规律和有效进行流脑疾病控制具有重要意义。

吉兰-巴雷综合征相关空肠弯曲菌脂寡糖基因簇序列分析

目的:分析吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)相关空肠弯曲菌脂寡糖(lipo-oligosaccharides,LOS)基因簇序列特征。方法:利用PCR的方法分段扩增2株GBS相关空肠弯曲菌LOS的生物合成基因簇;对PCR扩增片段克隆测序并对其序列进行初步分析。结果:测序结果发现2株菌LOS基因簇序列为15895bp、12230bp,分别编码19个ORF、13个ORF。与已发表的LOS基因簇序列相比,其中一株为一新的GBS相关菌株LOS合成基因簇类别。结论:参与编码GBS相关空肠弯曲菌LOS生物合成基因簇结构复杂多样,本研究发现了又一种新的GBS相关菌株LOS类别。

空肠弯曲菌Ⅵ型分泌系统结构特征和菌株中分布

目的明确中国空肠弯曲菌VI型分泌系统基因簇的结构特征及其在菌株中的分布。方法对中国不同来源空肠弯曲菌菌株进行全基因组测序,并与数据库不同来源空肠弯曲菌菌株基因组序列和VI型分泌系统基因簇做比较分析。结果52株空肠弯曲菌经基因组系统发育分析被分为了6个进化分支,对应不同来源的菌株。空肠弯曲菌的VI型分泌系统基因簇大小约14 kb,包含14个基因,其中hcp等9个主要基因与其他细菌T6SS相同基因的同源性较高,但仍具有空肠弯曲菌独特的基因簇结构。有36.5%(19/52)空肠弯曲菌菌株含有VI型分泌系统基因簇,主要为鸡来源分支和混合来源分支中的鸡来源菌株;有83.3%(10/12)中国的鸡来源菌株携带VI型分泌系统基因簇。结论空肠弯曲菌的VI型分泌系统与鸡来源菌株密切相关。

EMA-qPCR检测空肠弯曲活菌方法研究

目的建立一种快速定量检测食品中“活的”空肠弯曲菌的技术方案。方法通过对103 CFU/m^10^6CFU/mL的空肠弯曲菌进行叠氮溴化乙锭(EMA)的前处理研究,建立区分死菌与活菌的EMA前处理技术,与荧光定量PCR检测弯曲菌的方法相结合,建立EMA-qPCR组合检测技术,并进行模拟食品标本的验证。结果空肠弯曲菌在103 CFU/mL^10^6CFU/mL内,EMA的最优使用浓度为5μg/mL,5μg/mL的EMA-qPCR可区分出死/活空肠弯曲菌混合物中的死菌和活菌,并成功应用于模拟食品标本中“活的”空肠弯曲菌的检测。结论EMA-qPCR可作为快速定量检测样本中“活的”空肠弯曲菌的方法。

從“聖門”到“詩家”——“風人”意念的轉向與明代詩論

"風人"一辭主要指《詩經》"國風"一脈的詩人,首先包括"國風"詩篇的作者,次被引申爲繼承"國風"抒情傳統的理想詩人的範型。作爲一種批評策略,"風人"的詩學原則與漢儒所奠定的經典解詩傳統呈現出同源而異趣的發展轍迹,其重心逐漸從"聖門"的經典語境過渡向"詩家"語境,被開啓章法、修辭、言意關係等語言情意結構層面的理解和研究維度。此一詩學轉向大致在明代以"辨體"爲理論要素的文章學語境中達到高峯,以許學夷《詩源辯體》爲集大成之標誌,完成對多種資源的綜合。"風人"的完整內涵至此包括諸如風刺、考正、比興、寄贈、微婉、溫厚、言近旨遠、不落言筌等一系列倫理價值或美感特質。

审查涉外经济合同应注意哪些问题

审查经济合同,特别是涉外经济合同,在我国还是近几年才规定为律师的一项业务的。最近,江苏连云港市曾对该市近年来签订的部分涉外经济合同进行了全面的审查,发现存在不少问题,最后作出决定:今后签订标的在人民币五十万元以上的涉外经济合同,必须先经律师审查,出具法律意见书,以把好法律关。这说明人们对律师审查合同的重要性有了越来越清醒的认识。如何使涉外经济合同做到平等、明确、真实、完善、合法,律师肩负极其艰巨而又光荣的任务。由于在全国范围内开展这项业务的时间不长,律师在这方面的经验还十分缺乏,本文试以连云港为例,对律师审查涉外经济合同的有关问题,进行一些初步的探讨。

上海县麦田杂草的种群变化及防除对策

用五级目测草害调查法,对全县麦田杂草种群的分布与危害作了调查。从调查结果看出,近年来麦田杂草种群起了很大变化。单子叶杂草占绝对优势,双子叶杂草居次。看麦娘、硬草和棒头草为麦田的主要杂草。牛繁缕密度下降,大巢菜、泥糊菜、一年蓬、紫苑等阔叶草有所增加。通过调查分析,明确了地域间杂草种群的分布与危害、杂草种群变化的原因及今后的防除对策。

4种弯曲菌国家标准株实验室评价及应用分析

目的依据《病原微生物菌(毒)种国家标准株评价技术标准》(WS/T 812—2022),对空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、乌普萨拉弯曲菌和红嘴鸭(海鸥)弯曲菌4个菌种标准菌株病原特征进行实验室验证,评价应用标准菌株作为参比菌株进行弯曲菌检验标准实验室检测的可行性。方法通过形态观察、生化试验及细菌动力学试验等方法获得标准菌株的菌落特点、形态特征、重要生化表型特征及运动特点;通过基因组测序获得菌株基因组水平遗传特征;通过琼脂扩散法和E-test法检测标准菌株的抗生素敏感性特征;通过空肠弯曲菌和结肠弯曲菌检验标准进行标准菌株作为参比菌种的应用评价。结果标准菌株空肠弯曲菌NPRC(S)01.13897、结肠弯曲菌NPRC(S)01.13898、乌普萨拉弯曲菌NPRC(S)01.13899和红嘴鸭弯曲菌NPRC(S)01.13900均符合弯曲菌对应菌种的病原特征,可以作为弯曲菌检验的参比菌株。结论本研究中的标准菌株具有相应菌种的病原特征,可作为弯曲菌检测及菌种鉴定的参比菌株。

空肠弯曲菌耐药谱特征分析

目的分析十几年间我国空肠弯曲菌临床分离株对10种抗生素耐药谱特征,了解我国空肠弯曲菌耐药的变迁趋势。方法采用世界卫生组织(WHO)全球食源性病原菌感染网络(GFN)推荐的弯曲菌琼脂稀释法,测定1995年至今分离的116株空肠弯曲菌对6类10种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。结果经对实验结果整体分析,甲硝唑的总体耐药率最高为97.4%(113/116),四环素为82.8%(96/116),环丙沙星为80.2%(93/116),萘啶酸为79.3%(92/116),左氧氟沙星和氨苄西林耐药率相同,为40.5%(47/116),氯霉素为18.1%(21/116),庆大霉素为8.6%(10/116),链霉素为4.3%(5/116),最低为红霉素0(0/116)。随着时间的推进,萘啶酸、环丙沙星、左氧氟沙星和氨苄西林的MIC有明显增高趋势;四环素、红霉素、庆大霉素、氯霉素和甲硝唑的MIC值变化不明显;链霉素的MIC值变化有下降的趋势。6.1%的菌株出现了8种抗生素多重耐药的结果,且菌株均出现在2010年后。经统计学分析,萘啶酸、环丙沙星、链霉素、庆大霉素、氯霉素和氨苄西林6种抗生素在2001年前、2001-2005年、2006-2010年和2010年后4个时间段中耐药率差异有统计学意义。结论空肠弯曲菌对红霉素、庆大霉素以及链霉素3种抗生素依旧保持了较高的敏感性,对萘啶酸、环丙沙星、左氧氟沙星、四环素、甲硝唑以及氨苄西林6种抗生素产生了较大程度的耐药。

蛋白电泳凝胶放置时间对蛋白丰度的影响分析

目的利用高分辨力的双向电泳技术检测蛋白电泳后凝胶中的蛋白含量随时间推移的损失情况。方法用双向电泳蛋白裂解液提取鼠疫EV菌株（无毒疫苗株）全菌蛋白并定量。取800肚gEV蛋白，平行进行两块双向电泳凝胶电泳，电泳结束后一块凝胶立刻固定并染色，另一块凝胶4℃放置8h后固定并染色，使用ImageMaster 2D Elite软件比较分析两块凝胶蛋白点数量及蛋白丰度。结果相比直接固定染色的凝胶，8h后固定染色的凝胶中蛋白点扩散丢失严重，比电泳后直接固定凝胶少346个蛋白点，且部分相邻蛋白点发生融合，含量在20～350ng的低丰度蛋白65．9％因蛋白扩散丢失。结论蛋白凝胶放置8h后大量低丰度蛋白由于扩散会丢失，并直接影响后续免疫印迹、质谱鉴定等实验结果的可靠性。

TaqMan-MGB探针实时荧光定量-聚合酶链反应检测肺炎支原体方法的建立

目的建立敏感、特异的TaqMan-MGB探针实时荧光定量一聚合酶链反应（real-timePCR）快速检测方法，为临床标本中肺炎支原体快速检测提供技术支持。方法选取肺炎支原体重复序列RepMP23中保守区域设计、合成特异性扩增引物和TaqMan—MGB探针，建立并优化real—timePCtt检测方法。对优化后的方法使用标准浓度核酸进行扩增效率、灵敏度及特异度评价，并与已报道的肺炎支原体荧光PCR方法进行比较。结果本研究建立的TaqMan—MGB探针荧光PCR方法对肺炎支原体的检测限为0．2cfu，比普通TaqManreal—timePCR检测限（3—5cfu）提高了一个数量级。其检测标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（R^2=0．999）。用该方法扩增23种呼吸道常见病原菌染色体及人类染色体，结果均为阴性，特异度为100％。结论TaqMan—MGB探针real—timePCR方法可快速、灵敏、特异地检测肺炎支原体，有很好的应用前景与价值。