结核杆菌侵染破骨细胞对骨质破坏相关因子表达影响的体外研究

目的:建立结核杆菌侵染破骨细胞(osteoclasts,OC)模型,探讨结核杆菌侵染OC后对骨质破坏相关因子表达的影响。方法:采集健康志愿者的外周全血,分离出外周全血中的单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),利用核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)以及巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor,M-CSF)诱导使其成为OC,对细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色。将已经构建好的具有卡那霉素(Kana)抗性的H37Rv pMV261-GFP绿色荧光结核菌株进行复苏并加入10%的油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶添加剂(oleic albumin dextrose catalase,OADC)、7H9以及含卡那霉素的结核杆菌专用液体培养基进行培养,放置于37℃的恒温箱中培养至光密度(optical density,OD)值为600nm时的0.5左右备用;以单纯OC培养为空白对照组;用结核杆菌以不同转染复数(multiplicity of infection,MOI)侵染OC 24h,采用MTT比色法检测细胞存活率最高的MOI为后续实验MOI,使用H37Rv以此MOI侵染OC为实验组;荧光显微镜及结核杆菌抗酸染色分别观测实验MOI时结核杆菌转染情况。实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测非受体酪氨酸激酶(C-src)、蛋白激酶K(cathepsin K,CK)、碳酸酐酶2(carbonic anhydrase 2,CA2)、整合素-β3(integrin-β3)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达情况;免疫组化(immunohistochemistry)检测磷酸化酪氨酸激酶产物(P-src)、CK、CA2、Integrin-β3、MMP-9的细胞表面蛋白表达情况;蛋白免疫印迹(western blot,WB)检测P-src、CK、CA2、Integrin-β3、MMP-9的蛋白表达水平。结果:TRAP染色显示细胞培养15d后90%以上为OC,可以用于进行实验。荧光结核杆菌成功将其OD值培养为600nm时的0.5。MTT比色法结果显示:在MOI为20∶1时细胞存活率最高(P<0.05),此为实验组MOI;结核杆菌侵染OC后荧光显微镜显示:MOI为20∶1时,绿色荧光标记的结核杆菌进入OC,说明成功转染OC;结核杆菌侵染OC后抗酸染色结果显示:MOI为20∶1时,被染成红色的抗酸结核杆菌进入OC,说明结核杆菌H37Rv成功转染OC。qRT-PCR、细胞免疫组化、WB检测结果均显示:MMP-9、CK、C-src、CA2、Integrin-β3的表达实验组均高于空白对照组(P<0.05)。结论:结核分枝杆菌能够转染OC;与空白对照组相比,结核杆菌转染OC的实验组中5种具有骨质破坏作用因子均升高,提示结核骨质破坏可能与此相关,为骨结核疾病诊疗提供新的探索方向。