人骨髓基质细胞中糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶DcDNA的克隆

为探讨人糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)cDNA的结构及功能 ,应用RT PCR从人骨髓基质细胞中克隆了长约 2 6kb的GPI PLDcDNA ,包含完整阅读框架 ,编码 2 3个氨基酸的信号肽及 817个氨基酸的成熟肽 .该cDNA与人胰腺GPI PLDcDNA几乎百分之百同源 ,与人肝脏GPI PLDcDNA同源性为 95 %,氨基酸同源性为 94 %,3者对应的结构基因只有 1个 ,位于人类第 6号染色体上 ,基因组序列长约 80kb ,包括 2 5个外显子 .构建克隆的GPI PLDcDNA的真核表达载体 ,通过脂质体转染能表达GPI锚定的胎盘型碱性磷酸酶 (PLAP)而无GPI PLD活性的G9细胞 ,同时设立对照组检测GPI PLDcDNA的功能 .结果显示 ,对照组细胞几乎检测不到GPI PLD活性 ,其表达的PLAP主要位于细胞膜上 ;而转染GPI PLDcDNA的G9细胞能检测到较高水平的GPI PLD活性 ,而且大部分酶活性存在于培养液中 ,其表达的PLAP也主要被释放入培养液 .结果证实 ,从人骨髓基质细胞中克隆的GPI PLDcDNA有生物学功能 ,它能释放细胞膜上GPI锚定蛋白质 .

竞争性RT-PCR法定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D基因的表达

目的 :建立一种定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,以研究GPI PLD与白血病等疾病的关系。方法 :首先用PCR定点诱变法构建GPI PLD的竞争性cDNA模板 ,该模板与靶cDNA具有相同的引物结合区 ,但在长度上要比靶cDNA少 2 0个碱基。把该竞争性cD NA模板在体外转录出的竞争性RNA作为RT PCR的内标准 ,与白血病细胞株K5 6 2细胞的总RNA在同一体系内进行逆转录和PCR扩增 ,二者的PCR产物因长度不同可经电泳区分开 ,然后对电泳图像进行光密度扫描 ,根据已知的竞争性RNA模板的量计算出GPI PLDmRNA的量 ,从而得到GPI PLD基因的绝对表达量。结果 :构建和制备了长度为 198bp的GPI PLD竞争性RNA模板 ,该模板与靶模板呈明显的竞争性RT PCR反应 ;测得K5 6 2细胞GPI PLD基因的表达水平为每纳克 (44 0± 2 0 )拷贝。结论 :成功地建立了一种定量检测GPI PLD基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,该方法具有灵敏、准确等优点。

人糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D的基因结构初探

探讨人糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D (GPI PLD)的cDNA及其基因组基因的结构。从人骨髓基质细胞克隆出的GPI PLDcDNA中发现 ,它能编码信号肽 ,其编码的酶蛋白成熟肽为 817个氨基酸残基。该GPI PLDcDNA与从人肝组织和胰腺组织克隆到的GPI PLDcDNA的碱基序列的同源性分别为 95 %和 99%。人GPI PLD基因组基因定位于 6p2 2 .1～ 2 2 .3区域 ,包含 2 5个外显子 ,其上游调控区具有启动子 (TATA盒与CAAT盒 )、增强子核心序列 (TGGAAG)及同源转换盒Pit 1/GHF 1结合序列 (TATGCATAA)等顺式作用元件。

糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D的研究进展

羧基端结合有糖基化磷脂酰肌醇 (GPI)结构的膜蛋白 ,称为 GPI锚定蛋白 ;此后不久又鉴定出一种 GPI锚定蛋白专一性的磷脂酶 D(GPI- PL D)。 GPI- PL D能特异性地水解 GPI、释放出锚定蛋白并调节锚定蛋白的表达和生物功能等。本文概述了近年来有关 GPI- PL D的研究状况 ,包括它的组织和器官来源、生理功能、病理条件下的活性改变、分子结构以及 c

正常人与系统性红斑狼疮患者白细胞GPI-PLD基因多态性分析

目的 检测湖南地区汉族系统性红斑狼疮 (systemiclupuserythematosus ,SLE)患者外周血白细胞糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D (glycosylphosphatidylinositol-specificphospholipaseD ,GPI -PLD)基因外显子 1及外显子 2 5多态性、白细胞GPI -PLD活性及二者关系。方法 聚合酶链式反应与单链构象多态性分析 (PCR -SSCP)、测序技术进行多态性分析 ,利用自制具完整糖基化磷脂酰肌醇 (GPI)结构的胎盘碱性磷酸酶 (PLAP)做底物通过TX -114分相 ,定量检测白细胞中GPI -PLD活性。结果 湖南地区汉族 62名SLE患者与 10 9名正常人外周血白细胞GPI -PLD基因外显子 1区均存在 14处核苷酸改变 :转录起始点上游 -2 8A→C、-2 1C→T、-14G→A、-13G→C、-9T→C、-8G→C、-7G→C、+4T→G、密码子 14TTG→AAG (Leu14Lys)、密码子 17CTC→GTC(Leu17Val)、密码子 2 0AGA→AAA (Arg2 0Lys)、密码子 2 1GGT→GGG (Gly2 1Gly)、密码子 3 0GTA→ATA (Val3 0Ile) ;另转录起始点上游 -2 4C→T仅存在于SLE人群中 ,此变异在两组人群中具有显著性差异 ;该基因外显子 2 5 ,即 +60 496G→A均存在于两组人群中。经SSCP检出阳性率分别为正常人 3 3 0 3 %,SLE患者 2 5 81%。检测 62例SLE患者外周血白细胞GPI -PLD活性 (转化底物百分率 )

几种肝脏疾病血清中糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D的活性改变

目的 观测几种肝脏疾病患者血清中糖基化磷脂酸肌醇特异性磷脂酶D(GPI -PLD)的活性改变。方法 利用自制的具完整糖基化磷脂酰肌醇 (GPI)结构的胎盘型碱性磷酸酶 (PLAP)做底物 ,通过TX - 114分相 ,定量测定血清GPI-PLD的活性 ,用SPSS 10 0统计软件分析资料。结果 检测 172例肝脏疾病患者 (包括A组 :2 6例急性重症病毒性肝炎 ;B组 :2 9例肝硬化 ;C组 :32例慢性病毒性肝炎 ;D组 :55例急性非重症病毒性肝炎 ;E组 :30例原发性肝癌 )血清中GPI -PLD的活性 (转化底物的百分率 ) ,发现A、B两组患者的该酶活性较正常人 (182名 )显著性降低 ,而D、E两组则较正常人显著性增高 ,C组患者的酶活性与正常人无显著性差异 ,但A、B、C、D、E两组之间的酶活性水平改变却均有显著性。结论 检测患者血清GPI -PLD活性水平 ,既可作为临床诊断急性病毒性肝炎、肝硬化、原发性肝癌等肝脏疾病的一项生化指标 ,也可作为这些疾病临床疗效和预后的一项判断指标。