FTO及其抑制剂对DLBCL利妥昔单抗耐药的影响

目的探讨脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)及其抑制剂对弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)利妥昔单抗耐药的影响。方法选取2种“双重打击”淋巴瘤衍生的细胞系,活化B细胞样(ABC型)OCI-LY8(LY8)和生发中心B细胞样(GCB型)OCI-LY18(LY18),采用梯度加药法构建利妥昔单抗耐药细胞系(LY8R、LY18R);运用CCK-8法检测不同浓度利妥昔单抗分别干扰亲本及耐药细胞后的细胞存活率并计算半数抑制浓度(IC_(50))值;AnnexinⅤ/PI双染法检测亲本及耐药细胞的凋亡率;RT-qRCR、免疫荧光和Western blot检测在耐药细胞株中去甲基化酶FTO的表达情况;在耐药细胞株中加入甲氯芬酸钠(MA)抑制FTO表达,用RT-qRCR和Western blot验证抑制情况,并通过Western blot分析抑制耐药株中FTO后,c-Myc和CEBPA的表达情况。结果与亲本细胞比较,在利妥昔单抗耐药的细胞株中,去甲基化酶FTO、c-Myc表达均增加,CEBPA表达降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。耐药细胞株经MA处理后,FTO、c-Myc表达降低,CEBPA表达增高,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论FTO在耐药株中表达明显增高,MA可抑制DLBCL耐药细胞中FTO表达,可能对利妥昔单抗耐药的DLBCL患者有治疗的潜能。

弥漫性大B细胞淋巴瘤治疗中利妥昔单抗耐药与Smarcal1、PP2A-B55-α、PP2A-B56-α蛋白表达的相关性

目的探讨弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)治疗中利妥昔单抗耐药与Smarcal1、PP2A-B55-α、PP2A-B56-α蛋白表达的相关性。方法选取2种“双重打击”淋巴瘤衍生的细胞系,活化B细胞样(ABC型)OCI-LY10(LY10)和生发中心B细胞样型(GCB型)OCI-LY18(LY18),利用“梯度加药法”构建利妥昔单抗耐药细胞系(LY10RR及LY18RR);采用CCK-8法检测不同浓度利妥昔单抗分别干扰亲本及耐药细胞后的细胞存活率并计算半数生长抑制浓度值(IC_(50));AnnexinⅤ/PI双染法检测50μg/mL利妥昔单抗分别干扰亲本及耐药细胞48 h后的凋亡比率;western blot检测细胞耐药后对Smarcal1、PP2A-B55-α和PP2A-B56-α蛋白表达的影响;在耐药细胞系中分别干扰Smarcal1和PP2A-B55-α的表达以及过表达PP2A-B56-α,采用CCK-8法检测不同浓度利妥昔单抗对转染后耐药细胞活力的影响。结果经不同浓度利妥昔单抗处理48 h后,LY10及LY10RR细胞IC_(50)分别为(0.91±0.07)μg/mL和(287.40±26.30)μg/mL,耐药指数为315.58;LY18及LY18RR的IC_(50)分别为(4.73±0.24)μg/mL和(532.10±37.95)μg/mL,耐药指数为112.41,二者差异具有统计学意义(t值分别为10.51和15.18,P均<0.001);经50μg/mL利妥昔单抗处理48 h后,LY10RR和LY18RR的凋亡率与对照组的细胞凋亡率相比,差异均无统计学意义(t值分别为2.86和2.90,P值分别为0.06和0.05),而利妥昔单抗处理48 h后,LY10和LY18的凋亡率明显高于对照组细胞的凋亡率,且差异有统计学意义(t值分别为10.50和9.86,P均<0.001)。与亲本细胞相比,在发生利妥昔单抗耐药细胞系中,Smarcal1和PP2A-B55-α表达量增加,PP2A-B56-α表达水平下降,且差异均具有统计学意义(P均<0.05)。耐药细胞系转染并经不同浓度利妥昔单抗处理后,sh-Smarcal1组、sh-PP2A-B55-α组细胞存活率均明显低于sh-NC组,oe-PP2A-B56-α组细胞存活率明显低于oe-vector组(P均<0.01)。结论成功构建并鉴定稳定的对利妥昔单抗耐药的LY10RR和LY18RR细胞模型,并证实了Smarcal1、PP2A-B55-α及PP2A-B56-α蛋白异常表达与DLBCL的利妥昔单抗耐药形成相关。