23株鸭疫里默氏杆菌贵州株的耐药及耐消毒剂基因分析

为指导鸭场防控鸭疫里默氏杆菌(RA)的感染,本研究对23株RA贵州株进行药敏试验,并经PCR对其耐药基因及耐消毒剂基因的携带情况进行检测。结果显示23株RA对氨基糖苷类(链霉素、卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那)、大环内酯类(阿奇霉素、红霉素、新霉素)等抗生素均有较强耐药性,菌株耐药率达78.26%以上。对头孢类(头孢氨苄)、氯霉素类(氟苯尼考)等抗生素较敏感,菌株敏感率达69.56%以上。耐药基因检测结果显示,23株RA中,四环素类[tet(X)]、喹诺酮类(oqxA、oqxB)、大环内酯类(ermF)耐药基因检出率达100%(23/23);氟苯尼考类(floR)、氨基糖苷类[aph(3')-Iia、rmtC、cc(6')-Ib]、β-内酰胺类(blaSHV、blaDHA)、喹诺酮类(qnrA、qnrB)耐药基因检出率分别为82.61%(19/23)、95.65%(22/23)、82.61%(19/23)、73.91%(17/23)、4.35%(1/23)、4.35%(1/23)、17.39%(4/23)、78.26%(18/23)。经分析,23株RA耐药性较强,且最少耐8种抗生素,最多耐15种抗生素,存在严重的多重耐药性。耐消毒剂基因检测结果显示,仅检出16株RA携带耐季铵盐类(qacE、qacE△1)基因。上述结果表明,23株RA耐药性较强,且存在严重的多重耐药性,携带多种耐药基因和耐季铵盐类消毒剂基因。本实验为鸭疫里默氏杆菌病的有效防治提供了实验数据和参考依据。

羊口疮病毒B2L和F1L截短融合基因原核表达产物的免疫原性分析

为分析羊口疮病毒(OrfV)B2L和F1L截短融合基因表达蛋白的反应原性,本研究分别选取B2L、F1L基因序列的主要抗原区域,采用重叠延伸PCR将二者融合后克隆至原核表达载体pET-32a中,构建重组质粒pET-32a-B2L-F1L,通过PCR、双酶切和测序鉴定,结果显示获得1080 bp的B2L-F1L融合基因目的片段,测序结果经比对分析正确无误,表明正确构建了重组表达质粒pET-32a-B2L-F1L。将pET-32a-B2L-F1L转化BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果显示表达了39 ku的重组蛋白rB2L-F1L。采用Ni-IDA亲和层析方法纯化重组蛋白,经western blot鉴定,结果显示获得39 ku的单一特异性条带,表明rB2L-F1L的纯化效果和免疫原性均较好。采用rB2L-F1L纯化蛋白皮下多点注射免疫羔羊,采用ELISA方法检测免疫后不同时间羔羊血清中的OrfV抗体、IL-2、IFN-γ和IL-4细胞因子。结果显示,与生理盐水组相比,rB2L-F1L能够诱导羔羊产生OrfV特异性抗体,并可显著或极显著诱导羔羊分泌IL-2、IFN-γ和IL-4细胞因子(P<0.05、P<0.01);与弱毒活疫苗组比较,除在免疫后14 d~28 d时rB2L-F1L诱导羔羊产生的IL-2水平显著低于弱毒活疫苗组外(P<0.05),其他细胞因子在各时段两组均无显著差异(P>0.05)。本研究首次将OrfV优势抗原基因融合表达并分析了融合蛋白的免疫原性,为OrfV的检测技术和基因工程亚单位疫苗的研发奠定了良好基础。

一例猫真菌性皮肤病的诊疗

文章介绍了对1例猫真菌性皮肤病的诊疗情况,通过基础检查及实验室检查综合诊断为小孢子菌及马拉色菌混合感染,采用抗真菌和补充营养相关药物治疗后痊愈,后期复查未检测到相应菌体。

羊口疮病毒PMA-PCR检测方法的建立

【目的】为快速有效评估宿主动物体内及周围环境中的羊口疮病毒(Orf virus,OrfV)是否失活,本研究应用核酸染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)联合PCR扩增技术,以F1L基因为靶向检测对象,旨在建立一种针对具有感染活性OrfV的PMA-PCR检测方法。【方法】将病毒悬液经不同温度相同时间的水浴处理,通过PCR确定病毒样本最佳的热灭活温度;分别设置PMA曝光时间梯度及浓度梯度,进一步对PMA的曝光时间和工作浓度等因素进行优化,确定有效区分具有感染活性OrfV和失活OrfV的PMA最佳处理条件;对所建立PMA-PCR方法进行特异性试验验证,并通过对不同数量比例的热灭活OrfV、活OrfV混合病毒悬液样本进行检测来验证该方法的敏感性。【结果】OrfV样本经60℃热水浴处理10 min即可被完全灭活;PMA与失活OrfV的DNA共价结合且溶液中游离PMA光解的最佳曝光时间为15 min;热灭活OrfV基因组扩增被完全抑制的最小PMA浓度为20μmol/L,活OrfV基因组扩增不受抑制的最大PMA浓度为35μmol/L;特异性试验结果表明,该方法检测活OrfV时出现阳性条带,而口蹄疫病毒(FMDV)、绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)的扩增结果均呈阴性;经PMA处理后,在不同数量比例的活、热灭活OrfV病毒悬液中检测到活OrfV的灵敏度为10^(-1.68)TCID_(50)/0.1 mL。【结论】本试验成功建立了针对活OrfV的PMA-PCR检测技术,该方法特异性强、敏感度高,可为相关工作领域评估OrfV致病性提供技术参考。

羊口疮病毒与宿主互作研究进展

羊口疮是一种人兽共患传染病,主要由羊口疮病毒(Orf virus,OrfV)感染所致,目前尚无特效药物可治疗。囊膜蛋白是OrfV的主要抗原性蛋白,其机理主要是为病毒侵入宿主细胞创造一系列条件,同时降低宿主免疫力,增强了病毒的毒力。当病毒侵入宿主体内后,宿主会产生抗病毒免疫应答来清除病毒粒子,包括特异性体液免疫和非特异性细胞免疫应答,但主要以非特异性的细胞免疫应答为主。宿主对病毒会产生抗病毒免疫应答,同时病毒也会对宿主的免疫应答形成一种免疫逃避机制,通过该机制来躲避宿主免疫细胞对病毒粒子的捕获和清除,为病毒粒子在宿主体内的增殖、成熟及增强病毒毒力创造了各种条件。作者归纳总结了近年来羊口疮病毒与宿主互作的研究,阐述了OrfV囊膜蛋白的生物学功能、宿主的抗病毒免疫应答、病毒在宿主体内的免疫逃避机制和OrfV的其他一些毒力因子的致病作用,以期为羊口疮病毒的致病机制及疫苗防制研究提供参考。

羊口疮病毒DZ株在不同细胞上的增殖特性研究

为研究羊口疮病毒(ORFV)DZ株在不同细胞上的增殖特性,将ORFV-DZ株分别接种犊牛睾丸细胞(BT)和鸡胚成纤维细胞(CEF)2种原代细胞,以及山羊皮肤成纤维细胞系(GSFs)、小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH3T3)、宫颈癌细胞系(Hela)、牛肾细胞系(MDBK)、犬肾细胞系(MDCK)、非洲绿猴肾细胞系(Vero)、乳仓鼠肾细胞系(BHK-21)7种传代细胞,通过细胞病变(CPE)、间接免疫荧光试验(IFA)、TCID_(50)测定和实时荧光定量PCR检测ORFV-DZ株在不同细胞上的增殖特性。结果表明:ORFV-DZ株能在BT、Hela以及MDBK 3种细胞中有效增殖,且出现细胞变圆、聚集、脱落等CPE;IFA检测ORFV-DZ株接种这3种细胞均能出现特异性绿色荧光;收集BT、Hela和MDBK细胞培养的F5代细胞毒,测得其TCID_(50)值分别为10^(-5.81)·0.1 mL^(-1)、10^(-4.22)·0.1 mL^(-1)、10^(-4.88)·0.1 mL^(-1);qPCR检测结果中,ORFV-DZ株在BT细胞中随传代次数增加病毒拷贝数未发生明显变化,在MDBK细胞中F5代时病毒拷贝数已下降,而在Hela细胞中,随着传代次数的增多,病毒拷贝数逐步下降。这一研究得到了适合ORFV-DZ株有效增殖的细胞为BT和MDBK,为后续ORFV的基础研究以及疫苗研发等提供了细胞学研究基础。

羔羊睾丸细胞酵母双杂交cDNA文库构建及鉴定

为筛选与羊口疮病毒(OrfV)蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,构建了羔羊睾丸(LT)细胞酵母双杂交cDNA文库.采用Trizol法提取LT细胞总RNA,运用SMART技术经LD-PCR合成全长cDNA,再经同源重组法将pGADT7-Rec载体与cDNA共转化至Y187酵母菌株,利用营养缺陷型选择性培养基(SD/-Leu)筛选阳性克隆,并鉴定文库质量.结果显示:LT细胞酵母双杂交cDNA文库构建成功,其文库滴度为2.33×10^(8) CFU􀅰mL^(-1),文库容量达3.5×10^(9) CFU;随机挑选34个单克隆进行PCR检测,插入片段大小为250~2000 bp,平均大小约为1000 bp,文库重组率达100%.由此表明,本文库达到高质量文库条件,可作为研究OrfV与宿主细胞间互作机制的生物材料.

市售5种消毒剂对舍饲鸭场的杀菌效果评价

为了解贵州省某舍饲鸭场环境中菌落分布情况以及市售五种常用消毒剂(苯扎溴铵、月苄三甲氯铵、复方戊二醛、戊二醛癸甲溴铵、聚维酮碘)的灭菌效果,采集鸭场空气、粪便、垫料、饮水样本进行菌落总数测定。分别配制最小杀菌浓度的苯扎溴铵、月卞三甲氯铵、复方戊二醛及戊二醛癸甲溴铵4种消毒剂,采用雾线、喷洒消毒方式对舍饲鸭场空气、漏缝地板、料槽、蛋框及运输车车轮进行现场消毒;配制最小杀菌浓度的聚维酮碘,采用涂抹方式对鸭蹼部皮肤进行涂抹消毒;最后分别测定鸭场空气、漏缝地板、料槽、蛋框、运输车车轮及鸭蹼样本消毒前后的菌落总数并计算5种消毒剂对细菌的杀菌率。结果显示:舍饲鸭场空气菌落总数为3.79×10^(4)CFU/m^(3),超出NY/T 388-1999畜禽场环境质量标准规定数值(25000 CFU/m^(3));粪便菌落总数为2.67×10^(7)CFU/g,超出GB18596-2001畜禽养殖业污染物排放标准规定数值(1.03×10^(6)CFU/g);垫料菌落总数为3.7×10^(6)CFU/g,超出NY/T1167-2006畜禽场环境质量及卫生控制规范规定的清洁土壤数值(5×10^(4)CFU/g);饮水菌落总数为12 CFU/mL,符合GB 5749-2006生活饮用水卫生标准(100 CFU/mL)。5种消毒剂对鸭场进行现场消毒试验,复方戊二醛对漏缝地板、蛋框、运输车车轮的细菌杀菌率最高,分别为96.78%、81.31%、87.5%;戊二醛癸甲溴铵对鸭舍空气、料槽的细菌杀菌率最高,分别为34.85%、74.35%;聚维酮碘对鸭蹼部皮肤细菌杀菌率为72.45%;4种消毒剂对漏缝地板、料槽、蛋框、运输车车轮消毒效果良好,对空气的消毒效果不理想;聚维酮碘对鸭蹼部皮肤消毒效果不理想。结果表明:该舍饲鸭场存在大量超过国标菌落总数的安全隐患,通过对该鸭场微生物菌落计数及现场消杀试验,在一定程度将菌落总数控制在了合理范围。研究结果为掌握舍饲鸭场微生物菌落分布情况,制定舍饲鸭场消毒程序以及科学防控养鸭场细菌性疾病提供参考依据。

哪些场所应设置消防安全标志

消防安全标志是由安全色、边框和 以图像为主要特征的图形符号或文字 构成的标志,用于表达与消防有关的安 全信息。根据国家标准《消防安全标志 设置要求》,下列场所或部位应设置相 应的消防安全标志: 1、商场（店）、影剧院、娱乐厅、体 育馆、医院、饭店、旅馆、网吧、高层公 寓和候车（船、机）室大厅等公众聚集 场所的紧急出口、疏散通道、层间异位 的楼梯间（如避难层的楼梯间）、大型 公共建筑常用的光电感应自动门或 360度旋转门旁设置的一般平开疏散 门,必须相应地设置“紧急出口”标 志。在远离紧急出口的地方,应将“紧 急出口”标志与“疏散通道方向”标志 联合设置,箭头必须指向通往紧急出 口的方向。 2、紧急出口或疏散通道中的单向 门必须在门上设置“推开”标志。

羊口疮病的诊断及综合防治

羊口疮病是常见于绵羊和山羊的一种传染性疫病,该病可在短时间内快速传播蔓延,不仅严重影响羊的生长发育,给养殖户带来严重经济损失的同时也会威胁人类健康。本文通过对羊口疮病的流行特点、主要症状、诊断和防治措施进行介绍,以期给养殖户对本病的流行控制提供技术参考。

鸭疫里默杆菌LAMP-LFD快速检测方法的建立与初步应用

根据鸭疫里默杆菌(Riemerella anatipestfer,RA)ompA基因设计4条环介导等温扩增(LAMP)特异性引物和1条带有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的DNA探针,利用横向流动试纸条(LFD)检测扩增产物。通过对反应条件包括温度、时间、内、外引物浓度比、Bst DNA 2.0聚合酶浓度、dNTPs浓度及Mg^(2+)浓度等优化后,建立了RA的LAMP-LFD检测方法。结果显示:在64℃下运用LAMP扩增核酸到结果判读只需33 min;LAMP-LFD可特异性检测鸭疫里默杆菌,巴氏杆菌核酸、大肠杆菌核酸、沙门菌核酸、葡萄球菌核酸、鸭瘟病毒均未检测出;LAMP-LFD对pMD19-T-ompA最低检测浓度为1.83×10^(0)copies/μL,其敏感度是PCR的1000倍。利用PCR和LAMP-LFD检测22份疑似RA临床样本,两者检出符合率为100%。研究建立的LAMP-LFD检测方法能快速、特异地检测RA,可作为早期诊断和检测RA的有效手段。

兔肠道球虫病三重PCR方法的建立与应用

为建立一种能同时检测兔穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫的三重PCR方法,试验首先根据GenBank中的兔穿孔艾美耳球虫Eper基因、黄艾美耳球虫Efla基因、大型艾美耳球虫Eman基因序列设计3对特异性引物,通过优化PCR反应的退火温度和引物浓度,建立一种用于检测兔肠道球虫病的三重PCR方法,然后对该方法的特异性、敏感性及重复性进行评价,最后分别采用该方法及单一PCR方法对82份临床样本进行检测,计算两种方法的符合率。结果表明:所建立的三重PCR方法的最佳退火温度为59.7℃,最佳引物(F/R)浓度为0.15/0.15,0.20/0.20,0.20/0.20μmol/L(Eper、Efla、Eman基因);该方法能特异性扩增出兔穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫三种兔球虫卵囊靶基因,而斯氏艾美耳球虫、大肠杆菌及沙门氏菌的检测结果为阴性;能够检测出穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫三种兔球虫卵囊基因组DNA的最低限值分别为6.0,6.4,8.0 pg,两种模板浓度组合(60,64,80 ng/μL和6.0,6.4,8.0 ng/μL)批内重复性试验和批间重复性试验所有重复均扩增出预期目的条带;临床样本中,该方法的单一球虫检出率为53.6%,两种球虫检出率为30.5%,三种球虫检出率为7.3%;除黄艾美耳球虫+大型艾美耳球虫的混合感染类型两种方法检测结果的符合率为91.8%外,其他感染类型两种方法检测结果的符合率均为100%,整体符合率为98.8%。说明成功建立了一种可用于检测兔穿孔艾美耳球虫、黄艾美耳球虫、大型艾美耳球虫的多重PCR方法,该方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点。

一株鸭源沙门菌噬菌体的分离鉴定与生物学特性研究

为了获得鸭源沙门菌噬菌体,本研究以鸭源沙门菌为宿主菌,采用双层琼脂平板法从污水样品中分离纯化得到1株鸭源沙门菌噬菌体,对噬菌体的效价、形态、最佳感染复数(MOI)、酸碱耐受性、热稳定性进行测定,绘制了一步生长曲线,并进行了体外抑菌试验。结果显示,分离到1株鸭源沙门菌噬菌体,将其命名为BpS。该噬菌体能高效裂解鸭源沙门菌菌株,在菌苔表面形成清晰透亮、直径约为1.5 mm的圆形噬菌斑;效价为1.10×10^(10)pfu/mL;电镜观察噬菌体BpS直径约为100 nm,尾部直径约为20 nm,长约125 nm,属于有尾病毒目、肌尾病毒科;最佳感染复数为0.01;在pH为6.0~9.0时具有较高的抵抗力;温度低于50℃时存活率为80%以上;潜伏期和裂解期分别为20 min和70 min;体外抑菌试验表明,BpS可以在3 h内有效抑制沙门菌的生长。结果表明,噬菌体BpS裂解效果较好、特异性强,在生产中具有防治耐药鸭源沙门菌的潜力,有望成为防控耐药沙门菌的抗生素替代产品。

羊口疮病毒LAMP-LFD快速检测方法的建立与初步应用

根据羊口疮病毒(OrfV)的B2L基因设计4条环介导等温扩增(LAMP)特异性引物和1条异硫氰酸荧光素标记的DNA探针,再利用横向流动试纸条(LFD)检测扩增产物。通过对各反应条件包括反应温度、反应时间、内外引物浓度比、Bst DNA 2.0聚合酶浓度、dNTP Mix浓度、Mg^(2+)浓度以及探针结合温度等优化后,建立了检测OrfV的LAMP-LFD方法。结果显示,LAMP-LFD可特异性检测OrfV,而山羊痘病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒及丝状支原体山羊亚种等均未检出;LAMP-LFD对OrfV-B2L质粒DNA最低检测浓度为4.95×10^(-2)拷贝/μL,其灵敏度是以外引物建立PCR方法的1000倍。利用PCR和LAMP-LFD检测29份临床样品,两者检出符合率为100%。研究建立的LAMP-LFD检测方法可快速、特异地检测OrfV,可作为早期诊断和检测OrfV的有效手段。

徐深903-平1钻井液技术

本文通过分析深层水平井徐深903-平1井地质特点及施工难点,针对该井钻井液携岩能力要求高、润滑性要求高、抗温性要求高、易发生井漏等技术难题,尤其是水平段易发生严重漏失的难题,室内优选了新型抗高温降滤失剂及稳定剂,进一步改善了体系的高温流变性;优选了抗高温乳化石蜡与渣油复配替代原体系中的白油,大幅提高了体系的润滑防卡能力,确保了深井长期施工的安全,同时进一步降低了润滑材料用量,降低了钻井液成本。该井的顺利施工,对以后该区块这一类井具有指导意义。

鸭疫里默氏杆菌Porin蛋白的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用

旨在建立一种新型可适用于鸭疫里默氏杆菌(RA)病抗体检测的间接ELISA方法。以血清2型RA贵州分离株为研究对象,将其微孔蛋白Proin编码的基因克隆至pET-32a载体,构建重组表达质粒pET-32a-porin,在E.coli BL21(DE3)中使用IPTG诱导后表达。以纯化后的Porin蛋白作为包被抗原,通过一系列条件的优化建立一种检测RA抗体的间接ELISA方法,对其性能进行综合评价。结果显示,该方法具有较好的敏感性、重复性及特异性,阳性血清经1∶6 400稀释后检测结果仍为阳性,批内变异系数(CV)在1.27%~4.90%之间,批间CV在2.59%~5.43%之间,该方法可特异性地检测出抗RA抗体,与禽流感病毒(AIV)H5亚型、AIV H7亚型、新城疫病毒(NDV)、鸭圆环病毒(DuCV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)及E.coli阳性血清均无交叉反应,与商品化ELISA抗体试剂盒检测相比,两者符合率为97.26%。使用建立的ELISA方法对临床采集的801份样品血清开展抗体检测分析(626份为已免疫鸭传染性浆膜炎二价灭活疫苗“血清1型+血清2型”的样品血清,175份为未免疫任何鸭传染性浆膜炎疫苗的样品血清),有564份为免疫抗体阳性,检出阳性率为90.01%(564/626),有36份为感染抗体阳性,检出阳性率为20.99%(36/175)。结果表明,本研究建立了一种新型可用于RA抗体检测的间接ELISA方法,为RA的血清学流行病学调查提供了新的检测方法。

羊口疮病毒B2L、F1L截短融合基因的构建及生物信息学分析

为了构建羊口疮病毒(Orf virus,OrfV)B2L-F1L截短融合基因,并对该基因序列进行生物信息学分析,试验采用DNAStar生物信息学软件分别对B2L、F1L基因序列进行分析,截取B2L、F1L基因序列的主要抗原区域,分别设计引物,利用重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术对截取的B2L、F1L基因主要抗原区域进行融合,并与pMD-18T载体连接,构建重组质粒pMD18-T-B2L-F1L,经PCR鉴定、双酶切和测序验证正确后,应用生物信息学在线软件对B2L-F1L截短基因编码的蛋白质进行信号肽、跨膜结构、亲疏水性、柔韧性、抗原指数、抗原决定簇、糖基化结合位点、磷酸化结合位点、二级结构和三级结构进行预测。结果表明:构建的B2L-F1L截短融合基因大小约为1080 bp,与预期目的片段大小相符;该蛋白有信号肽、无跨膜结构域,亲水性、抗原指数及柔韧性较好,有17个抗原决定簇,2个糖基化结合位点和28个磷酸化结合位点,二级结构中以α-螺旋和无规则卷曲占比较大。说明试验成功构建出羊口疮病毒B2L-F1L截短融合基因。