胞外酸化经ASIC1/RIP1途径抑制TFEB介导的巨噬细胞脂噬

目的 探讨胞外酸化对巨噬细胞脂噬的影响及其作用机制。方法 采用RAW264.7巨噬细胞,以pH 6.5培养液与25 mg/L氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共孵育24 h构建胞外酸化诱导的泡沫细胞模型。分别以ASIC1特异性阻断剂PcTx-1和RIP1抑制剂Nec-1干预胞外酸化诱导的RAW264.7巨噬细胞24 h,油红O染色检测细胞内脂质蓄积;蛋白质印迹(Western blot)检测总ASIC1、膜ASIC1、p-RIP1 Ser166、p-TFEB Ser142、LC3和p62蛋白的表达;激光共聚焦显微镜观察脂滴(Bodipy示踪)与自噬标志物LC3II和LAMP1共定位;透射电镜观察细胞内脂滴和脂噬泡的数量变化;胆固醇荧光试剂盒检测ABCA1介导的胆固醇流出。结果 与pH 7.4组相比较,pH 6.5胞外酸化组胞内的脂质蓄积和细胞质膜上的ASIC1蛋白表达显著增加,p-RIP1Ser166、p-TFEB Ser142水平升高,LC3II蛋白减少和p62蛋白增加,脂滴与LC3II和LAMP1的共定位都分别减少,细胞内的脂滴数量显著增加,自噬体和脂噬泡的数量则明显减少,ABCA1介导的巨噬细胞内胆固醇流出显著减少。然而,胞外酸化对RAW264.7巨噬细胞的上述效应能被ASIC1特异性阻断剂PcTx-1和RIP1抑制剂Nec-1所取消。结论 胞外酸化经激活ASIC1/RIP1途径促进TFEB磷酸化抑制巨噬细胞脂噬,ASIC1可能是防治动脉粥样硬化等脂质蓄积疾病的新靶点。

普罗布考对2型糖尿病合并冠心病患者外周血单核细胞Toll样受体4/核转录因子κB信号通路的影响

目的研究普罗布考对2型糖尿病患者外周血单核细胞Toll样受体4/核因子κB信号转导通路的影响,以进一步探讨普罗布考抗动脉粥样硬化机制。方法选择85例2型糖尿病合并冠心病患者,随机分为对照组和治疗组:对照组按常规治疗,治疗组在常规治疗基础上加用普罗布考0.375 g,每天2次,口服,总疗程为24周。运用Real-time PCR、Western blotting方法分别测定治疗前后外周血单核细胞Toll样受体4、核因子κB mRNA和蛋白表达水平;ELISA检测外周血血清中白细胞介素1β的表达水平。结果普罗布考显著降低2型糖尿病合并冠心病患者总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和氧化型低密度脂蛋白水平,显著下调外周血单核细胞Toll样受体4 mRNA和蛋白的表达(P<0.05),明显减少核因子κB蛋白的表达,且显著抑制白细胞介素1β的生成(P<0.05)。结论普罗布考抗动脉粥样硬化除了降脂作用外,抑制外周血单核细胞Toll样受体4/核因子κB信号转导通路的激活,也可能是其抗炎、抗动脉粥样硬化的重要机制之一,提示普罗布考对防治2型糖尿病并发动脉粥样硬化这类患者有一定的作用。

抑制Toll样受体4对apoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化病变的影响

通过Toll样受体4(TLR4)抑制剂表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对TLR4途径的抑制,研究apoE-/-小鼠TLR4及多种炎症因子的表达和动脉粥样硬化病变程度的改变,以探讨TLR4途径在动脉粥样硬化病变发生中的作用.5周龄雄性apoE-/-小鼠50只,随机分成4组:基础饮食组对照组(n=12)、高脂饮食组对照组(n=12)、基础饮食+EGCG组(n=13)、高脂饮食+EGCG组(n=13).给药14周后处死动物,从主动脉根部连续冰冻切片,油红O染色观察主动脉窦处动脉粥样硬化(As)斑块面积,定量分析主动脉粥样硬化斑块大小及占管腔的面积百分比,采用Realtime-PCR检测主动脉TLR4mRNA和CD14mRNA的表达,蛋白质印迹检测TLR4和CD14蛋白表达,ELISA检测小鼠血清中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度.研究结果提示:EGCG显著减轻apoE-/-主动脉窦部的动脉粥样硬化病变,高脂对照组的主动脉窦AS斑块面积为(2.37±0.08)mm2,高脂饲料+EGCG组的主动脉窦AS斑块的面积为(1.05±0.13)mm2,EGCG组小鼠主动脉窦粥样斑块面积比相应对照组明显减少(P<0.05),高脂饮食+EGCG组小鼠TLR4蛋白表达显著降低(P<0.05),MCP-1,TNF-α的含量减少,与高脂饮食对照组相比差异有显著性(P<0.05).TLR4信号转导途径在高脂所致的AS发生当中有着重要作用,该信号途径的激活至少是AS发生当中的一个重要环节.

小干扰RNA沉默Toll样受体4表达对慢性温和应激ApoE^(-/-)小鼠腹腔巨噬细胞TLR 4/NF-κB途径基因表达的影响

目的探讨小干扰RNA(siRNA)沉默Toll样受体4(TLR4)基因对慢性温和应激ApoE-/-小鼠腹腔巨噬细胞促炎症细胞因子表达的影响。方法针对小鼠TLR4基因设计2条siRNA和一条无关序列,再据每一序列合成两条互补并含siRNA正反义链的DNA,退火后与含GFP的载体pRNAT-H1.1/Adeno相连,转染293A细胞,实时荧光PCR筛选有效的一条siRNA,经腺病毒颗粒包装与病毒扩增并感染293A细胞,G418筛选后,挑取单个阳性克隆放大培养,检测病毒滴度。120只雄性ApoE-/-小鼠随机分为三组:(1)慢性温和应激组;(2)慢性温和应激+siRNA组(10μL/只,尾静脉注射,每5日一次);(3)慢性温和应激+腺病毒空载体组。每组ApoE-/-小鼠40只,实验动物都以高脂、高胆固醇饲料喂养,分别在接受慢性温和应激0、4、12周后3个时间点处死动物,收集小鼠腹腔单核巨噬细胞,以W estern B lotting方法检测其TLR4和核因子κB(NF-κB)蛋白表达,ELISA法检测腹腔单核巨噬细胞培养上清液白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α表达。结果转染siRNA1和siRNA2后的292A细胞中TLR4 mRNA表达水平较空白对照组分别下降56%和67%,逐孔稀释滴度测定法测定的病毒滴度为3.4×1014TU/L;遭受4、12周慢性温和应激后,ApoE-/-小鼠血浆中皮质醇激素显著升高,但在同一时间点内,各组ApoE-/-小鼠血浆皮质酮激素浓度相比,差异没有统计学意义(P>0.05);与同一时期慢性温和应激组相比,siRNA组腹腔巨噬细胞TLR4和核因子κB蛋白表达水平明显降低(均P<0.05),其培养细胞上清液中的白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α含量显著减少(P<0.01)。结论 siRNA沉默TLR4基因能有效抑制TLR4/NF-κB-IL-1β和肿瘤坏死因子α的表达,提示TLR4/NF-κB途径在慢性温和应激诱导的慢性炎症应答中可能有着重要作用。

姜黄素下调脊髓Toll样受体4及下游细胞因子减弱大鼠神经病理性痛

观察鞘内注射姜黄素对坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)大鼠痛阈和脊髓组织Toll样受体4(TLR4)及TNF-α、IL-1β和IL-10表达的影响.鞘内置管的120只大鼠随机均分为4组:假手术组(Sham),CCI组,溶剂对照组(SC),姜黄素治疗组(Cur,100μg/天),建立CCI大鼠疼痛模型,术后第1、3、7、10和14天鞘内给药并测定痛阈,第3、7天取腰段脊髓第4～6节段(L4～L6)以Real-time PCR与Western blotting方法检测TLR4、HMGB1 mRNA和蛋白质的表达,ELISA法观察脊髓组织中TNF-α、IL-1β及IL-10表达变化.与Sham组相比,CCI组大鼠机械性痛阈与热痛阈显著降低(均P<0.05),同时脊髓组织TLR4、HMGB1 mRNA和蛋白质的表达明显增加(均P<0.05),TNF-α、IL-1β与IL-10的含量也明显升高(均P<0.05);鞘内注射姜黄素明显降低脊髓TLR4、高迁移率族蛋白1(HMGB1),TNF-α和IL-1β的表达,显著升高脊髓IL-10的表达,同时明显改善CCI大鼠疼痛行为(P<0.05).姜黄素减轻神经病理性疼痛可能与下调TLR4途径促炎症因子表达有关,抑制TLR4途径有望成为治疗神经病理性疼痛的新策略.

膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa单抗通过抑制HMGB1/TLR4途径减轻ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化(英文)

观察膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa单抗对小鼠动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)病变和HMGB1/TLR4途径基因表达变化的影响,以探讨膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂对As进程的影响及其机制.30只5周龄雄性ApoE-/-小鼠随机均分为3组:溶剂对照组(生理盐水50μl,腹腔注射),IgG对照组(50μg,腹腔注射),GPⅡb/Ⅲa单抗组(50μg,腹腔注射).实验ApoE-/-小鼠均已高脂、高胆固醇饲料喂养,10周后处死动物.油红O染色观察主动脉窦As病变;活体荧光显微镜观察颈总动脉As病变处血小板黏附;Western blot检测HMGB-1、TLR4与NF-κB蛋白的表达;免疫组化观察主动脉窦As病变部位MOMA-2和VCAM-1的表达;ELISA法检测血浆中HMGB-1、IL-1β、TNF-α与MCP-1的含量.研究结果表明:与对照组相比,GPⅡb/Ⅲa单抗组ApoE-/-小鼠As病变和血小板黏附显著减少(P<0.05);且该组小鼠主动脉TLR4与NF-κB蛋白的表达明显降低;其血清中的HMGB-1、IL-1β、TNF-α与MCP-1的水平也明显下降(P<0.05).此外,GPⅡb/Ⅲa单抗治疗显著减少As病变处MOMA-2和VCAM-1的表达(P<0.05).GPⅡb/Ⅲa单抗减轻ApoE-/-小鼠As病变可能与抑制HMGB1/TLR4途径介导的炎症有关.

慢性心理应激apoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化模型的建立与评价

目的探索建立慢性心理应激动脉粥样硬化动物模型。方法 4周龄80只apoE-/-小鼠随机均分为对照组与应激组,实验动物都以高脂、高胆固醇饲料(5%猪油,1%的胆固醇)喂养。应激组小鼠按顺序接受昼夜颠倒7或17 h(每周2次)、鼠笼倾斜成45度角7或17 h(每周2次)、噪声刺激9或15 h(每周2次,70 dB)与恐惧刺激1 h(放入大鼠刚住过鼠笼、每周2次)应激原的刺激;对照组的小鼠关在单独的实验动物房,除了不给予应激刺激外,其它的实验条件与应激组相同。分别在0、4、8与12周后4个时间点处死动物,检测血浆中总胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白与低密度脂蛋白水平;采用放射免疫测定方法测定血浆中皮质酮激素水平;油红O染色法观察主动脉窦动脉粥样硬化病变。结果应激组的总胆固醇、三酰甘油与低密度脂蛋白明显高于对照组(均P<0.05);与相应对照组相比较,应激组小鼠血浆中的皮质酮激素的水平显著升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001);主动脉窦动脉粥样硬化病变显著加重(均P<0.01)。结论成功建立慢性心理应激动脉粥样硬化动物模型。

β-榄香烯抗肿瘤作用和抑制微管蛋白体外聚合的研究

目的探讨β—榄香烯对微管蛋白体外聚合作用的影响,阐明其抗肿瘤的作用机制。方法采用MTT法测定β—榄香烯对体外培养的A549、WI38细胞增殖、生长的抑制作用;用浊度法测定β—榄香烯对提取的牛脑微管蛋白体外聚合的抑制作用。结果β—榄香烯能明显抑制A549、WI38细胞增殖、生长,其抑制作用呈浓度与时间依赖性;对A549、WI38细胞增殖的半数抑制率(IC50)分别为2.73μmol/L、3.53μmol/L。β—榄香烯明显抑制体外微管蛋白的聚合,并与药物浓度呈一定的线性关系,对微管蛋白体外聚合的半数抑制率(IC50)为5.12μmol/L。结论β—榄香烯对A549、WI38细胞增殖、生长有明显的抑制作用,β—榄香烯抑制微管蛋白的聚合是其抗肿瘤作用的重要机制之一,并与微管蛋白稳定剂紫杉醇的作用机理不同。

虚拟实验在医学机能实验教学改革中的应用探索

机能实验学教学改革是目前医学教育改革的热点问题。机能实验学虚拟实验教学的探讨与研究,既可克服传统机能实验教学的局限性;又可提升学生的基本素质与创新能力,实现高校培养高素质医学人才的办学目标。

独立学院校企合作培养模式的现状分析与发展对策——以南华大学船山学院为例

构建校企合作培养模式是独立学院实施教育教学改革,提升办学竞争力的着力点和必然要求。立足于独立学院校企合作人才培养模式的现状分析和问题研究,提出了转变管理者教育思想观念、深化教学改革、加强双师型师资队伍建设及建立健全互利共赢的长效机制等措施和对策。

载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块中血小板因子4和Toll样受体2的表达

目的观察高脂饲养的载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块表达Toll样受体2和血小板因子4的情况,探讨血小板因子4对内皮细胞Toll样受体2表达的影响。方法高脂饲料喂养载脂蛋白E基因敲除小鼠12周,建立动脉粥样硬化模型。安乐死处死动物,原位灌流固定,取主动脉于10%中性缓冲福尔马林中固定,石蜡包埋连续切片,HE染色观察动脉粥样硬化斑块形态,免疫组织化学检测斑块中Toll样受体2和血小板因子4的表达。结果载脂蛋白E基因敲除小鼠血脂水平明显增高,主动脉HE染色可见态动脉粥样硬化病变。在载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉富含脂质斑块中Toll样受体2表达上调,其中血管内皮细胞、巨噬细胞表达Toll样受体2明显增多。载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉斑块中也发现有血小板因子4表达,主要在内皮细胞和动脉粥样硬化斑块肩部。结论1.载脂蛋白E基因敲除小鼠粥样斑块中Toll样受体2表达上调,并且Toll样受体2主要表达在粥样斑块的内皮细胞和巨噬细胞上。2.载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块中可见血小板因子4表达。

多媒体结合案例教学法在生理学理论教学中的应用

多媒体结合案例教学法是理论联系实际的有效教学方法,在此究将此法运用于生理学理论教学中并进行评价。大多数学生肯定了这种教学方法。期末考试中学生的成绩显示实验班平均分明显高于对照班(P<0.05),主观题正答率高于对照班(P<0.05)。说明此法值得进一步推广。

在《生理学》教学过程中应用案例结合情景模拟教学法的探讨

在《生理学》教学中实施案例导入与情境模拟相结合,改变以往以教师为中心的被动教学局面,创立以学生为中心和主体的教学模式和氛围,使教学内容由呆板变为形象生动,由难以理解变为通俗易懂,有利于培养医学生的逻辑思维能力,有利于提高医学教育的教学质量,有利于为培养更多素质高、能力强、有创新性的医学专业人才。

生理学教学引入循证医学的探讨

生理学是基础医学的一门重要课程,其内容复杂,学习难度大。在生理学教学过程中引入循证医学的理念,可提高医学生的学习兴趣,改变学生的学习方法,变被动学习为主动学习,从而提高教学质量。