癌症的靶向基因—病毒治疗

肿瘤的单纯基因治疗或单纯肿瘤特异性增殖病毒治疗,都取得了一定的疗效,但都无重大突破。本文提出一种癌症的靶向基因病毒治疗新策略(targetinggene virotherapyofcancer),即将基因治疗与病毒治疗各自的优点结合起来,取得的疗效比上述任何单一的治疗都好。实验所用的载体是改造过的腺病毒ZD55或hTERT Adv,但单用一个基因还不足以完全消灭实验动物的肿瘤,因此进一步采用双基因治疗方案,即targetingdualgene virotherapyofcancer。如果两个基因选择恰当,当它们有协同效应或互补作用时,如Trail与K5,Trail与Smac,则基本可以全部消灭实验动物所荷肿瘤。此外,要取得癌症治疗的好结果,靶向性也很重要,故一种新的双靶向病毒调控双基因的癌症治疗策略被创造出来,并取得了很好的效果,申请了专利。无肠腺病毒为第三代腺病毒载体,它容量大,可克隆入很大的基因,又无免疫原性,可长期使用,如将前面各种良好肿瘤治疗策略结合运用到无肠腺病毒载体中,一定会构建出最好的肿瘤治疗方案,会使肿瘤治疗取得极好的效果。

低氧对NG108－15细胞生长及分化的影响

神经母细胞瘤和神经胶质瘤细胞融合的克隆细胞系ＮＧ１０８－１５细胞在含分化剂双丁基环化单磷酸腺苷（ｄＢｆｃＡＭＰ）的培养液培养后分化，成为具神经细胞特征的细胞。本实验利用四唑盐（ＭＴＴ）微量比色法，并结合焦油紫染色，测定和观察细胞的生长及分化状况，研究了低氧（２％Ｏ２＋９３％Ｎ２＋５／ＣＯ２）对未分化的，分化中的和已分化完成的ＮＧ１０８－１５细胞的影响。获得的主要结果是；低氧明显降低未分化细胞增殖和存活率，使分化完成的细胞大量死亡；低氧影响ＮＧ１０８－１５细胞的分化，使细胞在分化中出现体积膨大，突起短等异常特征，经焦油紫染色，胞质中无尼氏体（即不着色）的细胞增多。低氧是否可能使未分化ＮＧ１０８－１５细胞向更多地表达胶质细胞特征的方向分化？将是一个十分有趣的问题。

鸡胚与胎鼠的成纤维细胞条件培养液促进成肌细胞增殖和融合的比较

用培养过鸡胚(来亨鸡)或胎鼠(ICR小鼠)肌组织的成纤维细胞的条件培养液,定量地研究它们对胎鼠或鸡胚的成肌细胞的增殖和融合的影响。所得结果如下:(1) 胎鼠的成纤维细胞条件培养液促进胎鼠或鸡胚成肌细胞增殖,分别为对照组的2.65倍,(P<0.001)或2.35倍,(P<0.01);(2) 鸡胚的成纤维细胞条件培养液促进鸡胚或胎鼠的成肌细胞增殖,分别为对照组的2.66倍,(P<0.01)或2.17倍,(P<0.01);(3) 胎鼠的成纤维细胞条件培养液增加胎鼠或鸡胚的成肌细胞的融合率,分别为对照组的1.9倍或2.6倍;鸡胚的成纤维细胞条件培养液只增加鸡胚成肌细胞的融合率,为对照组的2.1倍,但对胎鼠成肌细胞的融合无明显的影响。 实验结果提示:成纤维细胞条件培养液促进成肌细胞的增殖,两种动物间无明显的差异,但在融合上却有一定的种属特异性。

癌特异性双靶向载体的安全性及其携带基因的杀伤性

背景与目的:我们创导的“癌症的靶向双基因-病毒治疗”策略可消灭移植性肿瘤,目前最重要的是要提高其安全性,使其只靶向肿瘤细胞,而在正常细胞内不复制或者很少复制。本研究旨在构建肿瘤特异性的双靶向腺病毒TD55,并研究其安全性;在TD55中插入凋亡基因TRAIL,构建成TD55-TRAIL,研究其杀伤性。方法:用hTERT启动子控制腺病毒复制必需的E1A基因,并将E1B55KD基因删除,构建肿瘤特异性的双靶向腺病毒TD55,使其只靶向p53功能缺乏的肿瘤。在TD55中插入凋亡基因TRAIL,构建成TD55-TRAIL,通过分子克隆构建质粒pTD55和pTD55-TRAIL,并与包装腺病毒的大质粒pBHGE3在293细胞中同源重组,得到腺病毒TD55和TD55-TRAIL。构建好的病毒体外感染人胚肺细胞MRC5、WI38,人结肠癌细胞SW620、HCT116、人肺癌细胞A549,分别用结晶紫染色法和MTT法检测其对细胞生长的影响。用流式细胞仪测定肿瘤细胞的凋亡率。结果:结晶紫染色结果和MTT结果表明,双靶向腺病毒TD55-TRAIL对正常细胞MRC5和WI38的杀伤作用比ZD55-TRAIL小很多。病毒复制能力分析表明,单靶向腺病毒在正常细胞中的复制倍数是双靶向腺病毒的3～5倍。TD55和TD55-TRAIL均能引起SW620细胞的凋亡,后者是前者的3.3倍。结论:双靶向腺病毒TD55-TRAIL对正常细胞的安全性比以往所构建的单靶向腺病毒ZD55-TRAIL更好,说明双靶向载体TD55比单靶向载体ZD55靶向性更高,如做为治疗药物可增加安全性,在治疗中可大大增加药物的安全性。携带的TRAIL基因能引起肿瘤细胞的凋亡,杀伤力较TD55增加数倍。

腺相关病毒携带hTERT启动子调控的TRAIL基因特异性杀伤肿瘤细胞

背景与目的:腺相关病毒(adeno-associated virus)作为载体已被广泛用于肿瘤的基因治疗研究。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factorrelated apoptosis-inducing ligand,TRAIL)基因可迅速诱导多种肿瘤细胞的凋亡,是一个安全有效的肿瘤杀伤基因。本研究旨在构建能在肿瘤细胞内特异性表达TRAIL基因的靶向腺相关病毒,并探讨其体外抗肿瘤效应的可能机制。方法:利用肿瘤特异性启动子端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)构建特异性杀伤肿瘤细胞的腺相关病毒载体pAAV-hTERT-TRAIL。通过与pAAV-RC、pHelper共转染HEK293细胞包装出病毒AAV-hTERT-TRAIL。将该病毒体外转染人结肠癌SW620细胞、人肝癌HepG2细胞、人肺癌A549细胞和正常细胞NHLF、MRC5后,检测TRAIL基因的肿瘤特异性表达。MTT法检测其对细胞增殖的影响,ELISA、Westernblot法以及流式细胞仪检测细胞的凋亡,并分析其体外抗肿瘤效应的可能机制。结果:成功包装出病毒AAV-hTERT-TRAIL。RT-PCR、Western blot和免疫组化法均证实AAV-hTERT-TRAIL能介导TRAIL基因在肿瘤细胞内特异性表达,但在正常细胞内不表达。以100 MOI AAV-hTERT-TRAIL感染细胞96h后,SW620、A549和HepG2细胞的增殖率分别是41.55%、44.29%、49.95%,NHLF和MRC5细胞的增殖率分别是84.59%和87.22%。Westernblot检测发现AAV-hTERT-TRAIL可激活Caspase通路,流式细胞仪和ELISA方法检测证实AAV-hTERT-TRAIL可诱导细胞凋亡。结论:hTERT的存在增强了腺相关病毒所携带TRAIL基因表达的肿瘤靶向性和对正常细胞的安全性,由它调控的杀伤基因可介导肿瘤细胞特异性的细胞毒效应。

带免疫佐剂CEA基因疫苗的构建及其稳定同步表达的研究

背景与目的:基因疫苗是目前肿瘤免疫基因治疗研究的热点。目前癌胚抗原阳性肿瘤的治疗效果不佳,本研究拟利用质粒pVAX1构建带有免疫佐剂白细胞介素2同步表达的癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,CEA)基因疫苗,探讨一种新的肿瘤生物治疗方法。方法:利用RT-PCR从患者肿瘤组织中钓取CEA目的基因cDNA;运用分子克隆技术,通过内部核糖体进入位点(IRES),将CEAcDNA和hIL-2cDNA连接于质粒pVAX1中,采用化学发光免疫法和ELISA双抗体夹心法分别检测CEA抗原和hIL-2因子的表达;同时用蛋白质分析软件分析和预测目的抗原的特性。结果:测序结果证实本实验所构建的重组质粒插入DNA序列无错配,质粒上所接入的CEAcDNA与GenBank公布的M29540和M17303的序列99.8%同源,经蛋白质分析软件预测,其抗原性、跨膜结构片段、信号肽位点和二、三级结构特征与同源癌胚抗原基本一致。hIL-2cDNA与母本序列100%同源。检测结果说明该重组质粒在体外CHO细胞株中可同步表达CEA和hIL-2分子。结论:从肿瘤组织中成功地获取了CEAcDNA,所构建的pVCEA2重组质粒能在体外细胞中同步表达CEA和IL-2蛋白分子,这为进一步体内实验研究基因治疗CEA阳性肿瘤提供了新的可能途径。

缺氧对离体鸡胚前脑神经细胞生长的影响

在缺氧(95％N_2和5％CO_2)条件下进行8d鸡胚前脑的纯神经细胞培养。培养24,48和72h后,MTT微量比色法检测显示,甲(目替)明显减少,表明神经元已遭严重损害,同时,培养液中葡萄糖被急剧地消耗。但是,即使把糖浓度提高到800—1200mg/100ml,缺氧仍造成神经细胞死亡。结果提示,胚胎脑神经细胞对缺氧敏感,胶质细胞对缺氧神经元的保护可能不在于提供糖原。

β-淀粉样蛋白对培养神经细胞的毒性作用及神经节苷脂的保护作用

向培养液中加入15mmol／L的β-AP1-40，48h后，发现原代培养的海马细胞内Ca2+的浓度明显增高，对照组为23．9±3．6（n=51）而β-AP组为36．5±15．8（n=30），两组比较P＜0．001，有非常显著性的差别。对照组的乳酸脱氢酶没有明显变化，而β－AP组在加β－AP1－4048h后乳酸脱氢酶明显增加，从52iu／L增加到105iu／L，实增加了101％。实验结果表明，β－AP1-40对培养的神经细胞有明显的毒性作用，但没有发现形态学的变化和对细胞的特异性。如在培养液中加β－AP1-40的同时再加25mg／ml的神经节苷脂（GAs）可明显减弱β-AP1-40引发的胞内Ca2+浓度和培养液中LDH浓度的升高。β-AP＋GAs组胞内Ca2+浓度为27.7±5.58，与β-AP组比较，有显著性差异（P＜0．01）。β-AP组海马细胞培养液中乳酸脱氢酶的浓度增高为101％，而β-AP-GAs组培养液中乳酸脱氢酶的浓度增高仅为67％。在NG108－15细胞上也获得了相同的结果。单唾液酸神经节苷脂虽有与GAs类似的作用，但较弱。这些实验结果指出，神经节苷脂和单唾液酸神经节苷脂均能拮抗β-AP1-40的毒性作用，从而对细胞可起到保护作用。

牛初乳提取物“乳珍”的氨基酸分析

牛初乳是母牛产犊后七天内所分泌的乳汁。其含有丰富的蛋白质,但理化特性不稳定、味苫,所以长期未得到充分的利用。我们依据营养学理论,将牛初乳研制成可食用的高蛋白补品“乳珍”经过了细胞学、生理学、免疫学和病理学等多种学科的实验,证实“乳珍”具有促逃机体发育。

乳珍对不同给氧条件下大脑神经细胞培养的影响

已有报道,大鼠服用牛初乳制品“乳珍”后,迷宫学习训练次数减少;也有实验表明,服用后,人鼠耐受缺氧的能力得到增强。本研究以体外培养的方法,观察乳珍是否能促进大脑神经细胞的发育并提高神经细胞耐受缺氧的能力。 1 材料和方法 1.1 神经细胞的制备和给氧条件的控制 本实验采用的细胞分离和培养方法已有描述。取8日龄来亨鸡胚前脑制备成细胞悬液,然后接种于预先涂以多聚赖氨酸(Sigma)的24孔培养板(Costar)孔内。

Ad.TERT-TRAIL对肿瘤细胞的杀伤作用及其机理

背景与目的:有学者用人端粒酶逆转录酶(TERT)启动子替换野生型腺病毒E1A自身的启动子,构建了一种肿瘤特异性增殖病毒,即溶瘤腺病毒Ad.TERT。细胞实验和动物实验表明,Ad.TERT有很好的抗癌作用。本研究目的是要在Ad.TERT中插入凋亡基因trail生成Ad.TERT-TRAIL,观察其是否具有更强的杀伤肿瘤细胞的功效并研究其机理。方法:通过腺病毒包装质粒pBH GE3与携带trail的小质粒pZhTERT-trail在H EK293细胞中同源重组构建Ad.TERT-TRAIL病毒,然后用PCR鉴定,并用W estern blot检测E1A、trail基因的表达以进一步确证。用结晶紫染色法和M TT法检测Ad.TERT和Ad.TERT-TRAIL对肿瘤细胞和正常细胞杀伤作用的差异。用W estern blot检测Caspase-3表达量以观察肿瘤细胞的凋亡情况,同时用流式细胞仪测定肿瘤细胞的凋亡率。结果:PCR扩增出来的条带为860bp,即为trail基因。W estern blot结果显示,Ad.TERT-TRAIL中的E1A和trail只在肿瘤细胞中表达,说明Ad.TERT-TRAIL构建成功。结晶紫染色结果表明,Ad.TERT-TRAIL对肿瘤细胞的杀伤力比Ad.TERT高10～100倍,而对正常细胞的影响跟Ad.TERT一样小。100M OI(m ultiple ofinfection)Ad.TERT-TRAIL感染结肠癌细胞SW62072h后,细胞存活率为4%;而感染了Ad.TERT的SW620细胞存活率却达56%。两种病?

双靶向溶瘤腺病毒MD55对肿瘤细胞与正常细胞的杀伤作用比较

应用分子克隆和同源重组技术构建双靶向溶瘤腺病毒MD55。分析MD55病毒在细胞中的复制能力,并用MTT和结晶紫方法检测MD55对肿瘤细胞和正常细胞生长的影响,West-ern印迹检测病毒感染后细胞中E1A蛋白和多聚ADP核糖聚合酶(PARP)片断的表达。结果显示,MD55能在MN/CA9阳性的肿瘤细胞SW620和OSRC-2中特异性表达E1A蛋白,并且在这些细胞中的复制能力和对这些细胞的杀伤性与对照病毒ZD55基本相同,而其在正常细胞中的复制能力很弱,对正常细胞的伤害很小;同时MD55可诱导肿瘤细胞SW620和OSRC-2的凋亡,而对正常细胞的凋亡无影响。实验结果表明双靶向溶瘤腺病毒MD55靶向性和安全性比单靶向病毒ZD55更高,有望成为一种很好的肿瘤靶向基因-病毒治疗载体。

去神经后小鼠骨胳肌胞纳的增加和卫星细胞增殖

用生物化学和体外培养法研究了小鼠骨胳肌的胞纳增加和卫星细胞增殖的关系。结果表明:(1)去神经4d或6d的肌肉可引起胞纳的增加和卫星细胞的增殖;(2)放线菌素D抑制正常肌肉的卫星细胞激活和胞纳作用;(3)在去神经的肌肉中,放线菌素D抑制了卫星细胞增殖的同时还抑制了胞纳的增加,但不能阻止去神经肌肉的萎缩。上述结果提示:肌肉的卫星细胞增殖和胞纳增加可能发生于去神经后某些因素的出现,或者胞纳的增加即是卫星细胞增殖的结果。

三种连接子多肽对抗癌融合蛋白翻译后剪切效果比较研究

IL-24和Smac为靶向癌症的多基因治疗研究中重要的候选基因.在构建IL-24和Smac双基因表达载体过程中,选择一个稳定高效的连接子非常关键.利用三个不同的连接子多肽序列IETD、EEED、F2A构建三个真核表达质粒pcDNA3.1(+)-IL-24-IETD-Smac、pcDNA3.1(+)-IL-24-EEED-Smac、pcDNA3.1(+)-IL-24-F2A-Smac,并联合5-氟尿嘧啶(5-FU)处理研究各连接子介导的融合蛋白剪切效果.上述实验结果表明,在三种IL-24-linker-Smac双基因表达载体中,F2A连接子剪切效果最佳且与caspase活性成正相关.IETD、EEED连接子介导的融合蛋白都有一定的剪切,但IETD/EEED多肽影响了上游IL-24蛋白的半衰期,加速了剪切后IL-24蛋白的泛素化降解.本研究为构建靶向癌症应用的双基因或多基因载体提供了设计参考.

构建重组腺病毒的新策略

重组腺病毒作为基因载体具有很多优越性,因此极大地引发了人们的研究兴趣.构建第一代和第二代腺病毒的方法各式各样,大体上可分为两类:一类是DNA直接在哺乳动物细胞内进行重组,另一类是先在细菌中构建好病毒DNA再转染哺乳动物细胞.而第三代腺病毒因缺失了大部分的病毒基因,构建时需要辅助病毒.几年前,腺病毒的构建还是一项耗时费力的工作,现在已经有了许多优化构建过程的新策略。

癌症的靶向基因-病毒治疗新进展及抗癌策略

我们创导的“靶向基因-病毒治疗”又有新进展,即癌症的靶向双基因-病毒治疗,能将小鼠移植性肿瘤全部杀灭,研究结果发表于Hepatology及CancerResearch(Highlightpaper)等杂志。在得到好的抗癌作用后,我们着重研究其安全性,故本文又介绍一种独特的癌症双靶向病毒-双基因治疗,其特点是利用癌症特异性启动子调控其特异性抑制基因,如用甲胎蛋白(!-fetoprotein,AFP)调控肝癌特异性抑癌基因LFIRE或HCCS1等,并在此基础上再加一个癌症特异性启动子如hTERT控制腺病毒E1A,构成癌症的双靶向病毒-基因治疗药物,即hTERT-E1A-AFP-E1B-HCCS1(或LFIRE),然后再与一个杀伤功能很强的hTERT-E1A-AFP-E1B-IL-24联合作用,构成癌症的双靶向病毒-双基因治疗。双基因有很好的杀伤性,双靶向有很好的安全性,因此,成为目前开发前景良好的抗癌药物。此外,本文还介绍了一种新型干扰素,它也有可能成为理想的抗癌药物。

携带mK5基因的重组腺病毒联合多西他赛对LNCaP细胞的体外抗癌作用探究

该文通过携带mK5基因的溶瘤腺病毒OncoAd-mK5联合多西他赛(docetaxel, DTX)处理前列腺癌细胞株LNCaP,以探究两者联合作用的体外抗癌效果。采用CCK-8法分别检测OncoAdmK5、docetaxel以及两者联合用药对LNCaP增殖的抑制作用;用显微镜分别观察OncoAd-mK5、多西他赛单独作用及两者联合作用引起的细胞形态学变化;利用Hoechst 33258染色、流式细胞术检测各处理组细胞的凋亡情况;Western blot检测E1A、m K5以及凋亡相关蛋白Caspase-8、XIAP、PARP的蛋白质表达水平;实时荧光定量PCR(Q-PCR)分析处理组细胞的血管内皮细胞生长因子(VEGF)mRNA水平变化。结果表明:感染复数(multiplicity of infection, MOI)=4的溶瘤腺病毒OncoAd-mK5与5 nmol/L的docetaxel能够协同抑制LNCaP的生长,且两者联合处理组的细胞凋亡现象比单独作用的效果更明显,这一新的药物组合为前列腺癌的临床治疗提供了参考。