三疣梭子蟹14-3-3基因的克隆及其在低盐和病原胁迫后的表达分析

本研究利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)14-3-3基因(Pt14-3-3)。Pt14-3-3基因cDNA序列全长为2510 bp,包含开放阅读框741 bp,编码由247个氨基酸组成的蛋白,分子量为27.98 kDa。序列比对结果显示,Pt14-3-3基因与中华绒螯蟹14-3-3基因同源性最高(100%)。系统进化树分析表明,Pt14-3-3氨基酸序列与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)紧密聚为一支。组织表达分析显示,Pt14-3-3基因在肝胰腺、肌肉、鳃、心脏、眼柄、血淋巴中均有表达,其中,在肝胰腺中的表达量最高。低盐胁迫后,Pt14-3-3基因在鳃和肝胰腺中的表达量分别于48 h和12 h显著上调并达到最大值,分别为对照组的1.34倍(P<0.05)和7.54倍(P<0.05)。人工感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和白斑综合征病毒(WSSV)后,Pt14-3-3基因在肝胰腺和血细胞中整体均呈显著上调表达,最高上调17.52倍(P<0.05)。本研究结果表明,Pt14-3-3基因可能在三疣梭子蟹低盐适应和免疫反应中发挥重要作用。

三疣梭子蟹Pt-ddit4l基因的克隆及表达分析

为明确三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)DNA损伤诱导蛋白因子-4(DNA Damage Inducible Transcript like 4,DDIT4L)基因的结构和功能。利用RACE方法克隆获得三疣梭子蟹Pt-ditt4l基因全长。该基因序列全长2727 bp,其中ORF为507 bp,编码了一个168个氨基酸的蛋白,预测分子质量为19.14 kD,且在C端有一个高度保守的RTP801_C结构域。Blast相似性比对和系统进化树分析发现,Pt-ddit4l与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)ddit4l基因的相似性最高为60%,且与凡纳滨对虾先聚为一支。梭子蟹不同发育阶段表达分析表明,Pt-ddit4l基因在发育早期发挥了一定的作用;组织表达分析显示,Pt-ddit4l基因在肝胰腺中的表达量最高,在血细胞中表达量最低。注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)后的感染实验表明,血细胞中Pt-ddit4l的表达量先上升后下降,在24h达到峰值,为对照组的8.85倍(P<0.05);而肝胰腺中则是整体呈下调的趋势,在72h时达到最低值,仅为对照组的1/40(P<0.05)。注射dsddit4l后该基因12—24h表达量显著下调,且注射dsddit4l后再进行弧菌感染的螃蟹的死亡率要显著远高于对照组。研究丰富了三疣梭子蟹DNA损伤诱导蛋白相关研究资料。

三疣梭子蟹C-型凝集素CTL5基因的克隆及在病原刺激下的免疫应答

为明确三疣梭子蟹Portunus trituberculatus C-型凝集素CTL5的结构和功能,采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA end,RACE)技术克隆获得三疣梭子蟹C-型凝集素CTL5基因(PtCTL5)的cDNA全长。结果表明:PtCTL5基因全长为1026 bp,包含732 bp的开放阅读框,编码了243个氨基酸组成的蛋白,相对分子质量为26000,为半乳糖结合型凝集素;Blast分析显示,PtCTL5氨基酸序列与克氏原螯虾Procambarus clarkia CTL的一致性最高,为41.84%;系统进化树分析显示,PtCTL5与已发表的三疣梭子蟹的另4种C-型凝集素亲缘关系较远;胚胎及幼体不同发育时期的定量分析表明,PtCTL5在溞状幼体Ⅲ期表达量最高,在胚胎发育的心跳期表达量最低;组织表达分析显示,PtCTL5在血细胞中的表达量最高,肝胰腺中次之;人工注射副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus后,PtCTL5在血细胞和肝胰腺中的表达量均于72 h时达到峰值;而注射对虾白斑综合征病毒(WSSV)感染后,PtCTL5在血细胞和肝胰腺中的表达量分别于72、12 h达到峰值且显著高于对照组(P<0.05)。研究表明,C-型凝集素在三疣梭子蟹先天免疫中具有一定的功能,本研究结果可为进一步解析三疣梭子蟹免疫应答机制提供参考。