不同降解方法对6A型肺炎球菌多糖结构和抗原性影响的研究

目的 研究采用过氧化氢法和高压均质法降解对6A型肺炎球菌多糖（type 6A pneumococcal polysaccharide,PnPS6A）结构和抗原性的影响.方法 分别采用过氧化氢法[将过氧化氢加入多糖（polysaccharide,PS）溶液中,50℃反应3 h]和高压均质法（用高压均质机在5×10^7 Pa压力下处理PS溶液）降解PnPS6A,降解物经超滤浓缩和冻干后,获得降解的PnPS6A.分别用核磁共振氢谱（nuclearmagnetic resonance hydrogen spectrum,^1H-NMR）和双向免疫扩散法检测PnPS6A降解物的结构和抗原性,用抑制ELISA检测降解和未降解的PnPS6A的抗原一致性.结果 2种降解方法均能降低PnPS6A的相对分子质量.2种降解的PnPS6A对PnPS6A抗血清抑制的半数有效浓度与未处理的PnPS6A为同一个数量级,表明降解的PnPS6A的抗原性没有改变.^1H-NMR分析显示,2种降解的PnPS6A的结构与未处理的PnPS6A一致.结论 2种降解方法都能降低PnPS6A的相对分子质量,而且对PnPS6A的结构和抗原性不会产生影响.

13价肺炎球菌结合疫苗在小鼠中的安全性及免疫原性评价

目的 评价13价肺炎球菌结合疫苗（13-valent penumococcal conjugate vaccine,PCV-13）在小鼠中的安全性及免疫原性.方法 将90只小鼠按简单随机法分为3组,分别免疫PCV-13、市售7价肺炎球菌结合疫苗（PCV-7）及生理盐水.于0、14、28 d分别进行3次皮下注射,观察免疫后小鼠的体重及状态变化至35 d.每组小鼠随机取10只在第14天进行眼眶采血,其余20只在第35天采血.采血后分离的血清于-40℃以下保存.用ELISA检测小鼠血清抗各型肺炎链球菌荚膜多糖IgG抗体水平.结果 PCV-13免疫小鼠的体重增加未受到抑制,且未观察到其他不良反应,疫苗的安全性良好.3针免疫后,PCV-13免疫小鼠的抗各型多糖抗体滴度都有上升,表明PCV-13具有良好的免疫原性.PCV-13与市售PCV-7对共同的7个血清型的免疫原性相同（t=0.004,P＞ 0.05）.结论 PCV-13在小鼠中具有良好的安全性和免疫原性,这为该疫苗的临床前研究提供了一定的理论依据.

8型肺炎球菌荚膜多糖分子大小对结合效果及结合物抗原性的影响

目的评价8型肺炎球菌荚膜多糖(capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae type 8,CPS8)分子大小对多糖蛋白结合物物理化学(理化)性质的影响,并对结合效果最优的多糖蛋白结合物进行抗原一致性评价。方法采用高压均质法制备不同分子大小的CPS8;采用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯活化法,制备以白喉类毒素无毒突变体CRM197为载体的CPS8蛋白结合物CPS8-CRM197,并检定其理化性质;采用核磁共振氢谱及核磁共振碳谱分析降解前后多糖糖链结构的变化情况,同时采用抑制ELISA评价CPS8-CRM197结合物的抗原一致性。结果高压均质法制备的CPS8相对分子质量在69000~268000;CPS8相对分子质量>200000时会过度交联,<100000时结合效果较差;CPS8在相对分子质量100000~200000之间的CPS8-CRM197结合物游离多糖含量均<10%,游离蛋白含量均<5%。核磁共振氢谱及核磁共振碳谱结果表明,降解前后多糖糖链结构未发生改变,特异基团得到完整的保留;抑制ELISA表明不同CPS8-CRM197结合物对8型肺炎球菌抗血清抑制的半数效应浓度在同一数量级内,分别为0.005、0.003、0.005μg/ml,抗原性具有一致性。结论多糖结合疫苗制备工艺中,应将CPS8分子大小控制在相对分子质量100000~200000之间,该范围内多糖所制备的多糖蛋白结合物理化性质较优、抗原一致性较好。

不同方法制备的4型肺炎球菌多糖-白喉类毒素结合物的免疫原性比较

目的比较以1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(1-cyano-4-dimethylamino pyridine tetrafluoroborate,CDAP)和溴化氰(cyanogen bromide,CNBr)为活化剂制备的4型肺炎球菌多糖(type 4 pneumococcal polysaccharide,PS4)-白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)结合物(PS4-DT)原液的免疫原性。方法分别以CDAP或CNBr为活化剂,各制备1批PS4-DT原液,并对原液的相关质量指标进行检测。分别用2种PS4-DT原液,间隔2周皮下注射NIH小鼠3次,末次免疫1周后采集血清,用ELISA检测血清抗体水平,比较不同方法制备的2种PS4-DT原液的免疫原性。结果 2种PS4-DT原液的主要质量指标均符合相关规定的要求,结合PS4的含量分别为257.1和203.1 μg/ml。2种PS4-DT原液均可与PS4抗血清发生特异性反应。抑制ELISA检测显示,2种PS4-DT原液对PS4抗血清的抑制率均达到100%。2种PS4-DT原液免疫小鼠产生的抗PS4抗体水平相近,抗体几何平均滴度分别为970.06和844.49。结论不同种方法制备的2种PS4-DT原液在小鼠中的免疫原性相似,且均可诱导小鼠产生较高水平的抗体。