中枢神经元凋亡模型的建立及其信号转导

程序性细胞死亡是多细胞机体在发育过程中调控机体正常生理功能的重要机制。日益增多的证据表明，某些中枢神经系统疾病的发生与发展涉及到神经元的程序性死亡。应用体外去极化条件下，原代培养的小脑颗粒神经元，经复极化处理，可以诱导典型的神经元程序性死亡。研究发现，小脑中广泛存在的神经递质谷氨酸和乙酰胆碱，可以通过特异性的受体调节神经元的程序性死亡。从而提示，神经递质在传导神经冲动的同时，也特异性地传导神经元的生存信号。进一步的实验证明，激活不同的Ｇ蛋白（Ｇｓ或Ｇｉ／ｏ）可以阻断或者诱导神经元的程序性死亡，提示Ｇ蛋白在神经元程序性死亡信号的跨膜传导过程中可能发挥双向开关的作用。某些神经系统药物（如苯妥英钠）和神经毒素（如胆红素）引起小脑萎缩的机制也可能与颗粒神经元的程序性死亡有关。

中枢型苯二氮受体研究

一、选题的由来苯二氮(艹卓)类(benzodiazepines,BZs)药物的研究始于50年代中期。由于其安全指数大、副作用小,现已成为处方频率最高的药物之一。据Tallman等的报道,美国10%的处方使用了该类药物,全年销售量高达8 000吨。

黑海参多糖对β-淀粉样蛋白诱导的皮质神经元凋亡的保护作用

体外培养大鼠皮质神经元 ,用β-淀粉样蛋白 (β- AP)诱导皮质神经元凋亡。黑海参多糖使皮质神经元存活率增加 ,使神经元的 DNA电泳图谱不出现“梯子状”,使神经元的流式细胞仪分析图上不出现凋亡峰 ,表明黑海参多糖对 β- AP诱导的皮质神经元凋亡具有保护作用。

黑海参酸性粘多糖的分离纯化

采用酶法和碱法消化、醋酸钾和乙醇分级沉淀,从新鲜黑海参体壁中分离得到酸性粘多糖,分子量为10253Da,经琼脂糖电泳证实为纯一成分,多糖组成中氨基半乳糖、葡萄糖醛酸、岩藻糖、硫酸基含量分别为16.12％、17.88％、11.66％、23.52％。

IGF-1经PI3K/Akt依赖性途径保护苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡

目的 观察胰岛素样生长因子 1 (insulin likegrowfactor 1, IGF 1)对苯妥英(100μmol·L-1 )处理的大鼠小脑颗粒神经元 (cerebellargranularneurons, CGNs)存活率的影响,并探讨其与PI3K/Akt通路的关系。方法 体外培养 8的小脑颗粒神经元,同时给予 100μmol·L-1苯妥英和μmol·L-1 IGF 1, 48h后行凋亡分析,观察IGF 1对苯妥英诱导的小脑颗粒神经元的保护作用;采用PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002(50μmol·L-1 )预先与小脑颗粒神经元孵育 30min,再加 1μmol·L-1 IGF 1和 100μmol·L-1苯妥英共孵育 48h,测定神经元存活率,观察IGF 1与PI3KAkt通路的关系;Westernblot法检测苯妥因处理不同时间小脑颗粒神经元内磷酸化Akt水平及总Akt的表达量,并观察IGF 1对磷酸化Akt水平的影响,进一步探讨IGF 1的作用是否经PI3K/Akt通路。结果 ①1μmol·L-1 IGF 1可明显抑制 100μmol·L-1苯妥英引起的小脑颗粒神经元的凋亡明显提高小脑颗粒神经元的存活率,使其凋亡特征消失。②PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002可取消IGF 1的保护作用。③苯妥英使小脑颗粒神经元内磷酸化Akt水平明显降低,但不影响总Akt表达量。④IGF 1可明显恢复被苯妥英抑制的磷酸化Akt的水平。结论 IGF 1保护苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡。

咖啡因对谷氨酸诱导神经元凋亡的保护作用

目的 研究咖啡因对谷氨酸诱导的神经元凋亡是否具有保护作用，并对其机制进行探讨。方法 采用ＤＮＡ凝胶电泳分析及Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８核染色方法进行凋亡分析；使用荧光指示试剂Ｆｕｒａ２检测单细胞内游离钙浓度变化。结果 谷氨酸可诱导小脑颗粒神经元凋亡，咖啡因能拮抗谷氨酸的这一效应，其ＩＣ５０为５－０ｍｍｏｌ·Ｌ－１。咖啡因的这一保护作用不能被ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ模拟，也不能被ＲｐｃＡＭＰ阻断。此外，内质网Ｒｙａｎｏｄｉｎｅ受体阻断剂ｄａｎｔｒｏｌｅｎｅ也不能取消咖啡因的保护作用，咖啡因不影响谷氨酸诱导的钙超载。结论 咖啡因对谷氨酸诱导的神经元凋亡具有保护作用，这一保护作用与咖啡因升高细胞内ｃＡＭＰ和Ｃａ２＋水平的药理作用无关。

基质金属蛋白酶-3在强直性脊柱炎中的作用和意义探讨

目的通过比较强直性脊柱炎(AS)病人抗肿瘤坏死因子(TNF)-α单克隆抗体药物(remicade)治疗前后的膝关节滑膜细胞的基因谱变化,找出缓解AS病情相关的主要基质金属蛋白酶(MMP)-3,并探讨MMP-3潜在调控的作用和在AS发病中的作用机制和意义。方法从AS病人在remicade治疗前和治疗3个月后的关节滑膜细胞的基因表达谱(用含1176基因的cDNA微阵列检测)结果中筛选的靶基因即差异表达最显著的MMP-3为特异性刺激因子,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测它诱导健康志愿者外周血单个核细胞(PBMC)的炎症相关基因TNF-α、c-jun和c-fos的表达。结果比较AS病人治疗前后的关节滑膜细胞基因差异表达的结果,MMP-3治疗后下调最显著(P=0.0147)。与MMP-3聚类在一起的基因有111个,和MMP-3相关性最强的基因是金属蛋白酶抑制剂前体(TIMP)-1;MMP-3能显著诱导PBMC的TNF-α、c-jun和c-fos的表达。结论在remicade治疗AS过程中,下调MMP-3是最重要的环节之一;通过检测MMP-3在关节滑膜细胞组织中的表达水平可作为AS诊断和病情进展监控的参考指标;MMP-3下调,可能使TNF-TNFR2-JNK-AP-1信息通道的激活状态减弱,从而减少致炎因子的释放,调整异常的基质降解和血管形成等病理因素,缓解AS炎症、减少软骨和骨质破坏的作用。

咖啡因对苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡的保护作用及机制

目的 观察咖啡因 (caffeine)对苯妥英 (diphenylhy dantoin ,DPH) 10 0 μmol·L-1处理的大鼠小脑颗粒神经元(cerebellargranularneurons ,CGNs)存活率的影响 ,并探讨其作用机制。方法 体外培养 8d的CGNs,同时给予 10 0μmol·L-1苯妥英和 1 2 5～ 2 0mmol·L-1咖啡因 ,4 8h后行凋亡分析 ;采用dantrolene(2 0 μmol·L-1)、2APB (5 0 μmol·L-1)、nifedipine(10 0 μmol·L-1)和nimodipine(10 0 μmol·L-1)、MK80 1(4μmol·L-1)、KN93(1μmol·L-1)以及MEK1抑制剂PD980 5 9(5 0 μmol·L-1)分别预先孵育 30min ,再与10mmol·L-1咖啡因和 10 0 μmol·L-1苯妥英共孵育 4 8h ,测定CGNs存活率 ,观察咖啡因的作用与 [Ca2 + ]i 的关系 ;Westernblot法检测咖啡因对磷酸化c Jun和磷酸化ERK水平的影响。结果 ① 1 2 5～ 2 0mmol·L-1咖啡因可浓度依赖性抑制 10 0 μmol·L-1苯妥英引起的CGNs凋亡 ,显著提高CGNs存活率 ;②dantrolene、2APB、nifedipine和nimodipine、KN93、MK80 1和PD980 5 9均不能取消 10mmol·L-1咖啡因对 10 0 μmol·L-1苯妥英引起的CGNs凋亡的保护作用。③咖啡因可明显抑制苯妥英诱导CGNs中c Jun磷酸化水平的升高 ,但不影响被苯妥英抑制的ERK的活性。结论 一定浓度的咖啡因可保护苯?

荧光差异显示PCR克隆大鼠脑缺血相关基因KIAA0280

【目的】研究大鼠急性局灶性脑缺血时缺血组织与非缺血组织中基因表达的差异,克隆出与脑缺血相关的基因。【方法】应用荧光差异显示PCR(FDDPCR)从同一例大鼠大脑皮层缺血组织和非缺血组织中筛选出有表达差异的基因片段,经反向Northernblot杂交,将杂交阳性的片段且经RT-PCR反复验证,选取差异明显的片段进行克隆测序;经生物信息学分析处理,选取同源性低的EST片段R6,利用cDNA5'端快速扩增PCR(5'RACE法)进行基因全长的克隆。【结果】利用5'RACE法成功地克隆EST片段R6至编码区,扩增并获取全长4821bp及完整的可读框(ORF),RT-PCR及Northernblot印迹结果证实了克隆的结果,同源性分析发现该基因ORF与人大脑中已知的KIAA0280基因高度同源,同源性96%,编码166个氨基酸,为结构及功能未明确蛋白质,该基因定位于大鼠第11号染色体长臂(11q.13)。【结论】应用荧光差异显示PCR成功地自大鼠体内克隆到与人KIAA0280相似的基因,其在大鼠急性局灶性脑缺血中明显上调,该蛋白质结构及功能均未见报道及研究,其显著地差异表达提示其在脑缺血病理过程中具有重要作用。

藻酸双酯钠对蜂毒肽诱导的皮质神经元凋亡的保护作用

目的 研究藻酸双酯钠（ＰＳＳ） 对蜂毒肽（ｍａｓｔｏｐａｒａｎ）诱导的皮质神经元凋亡是否具有保护作用。方法 体外培养大鼠皮质神经元，定性定量检测细胞凋亡：①用ＦＤＡ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ） 染色检测细胞存活率，用Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ 染色，分析细胞核的形态变化；②琼脂糖凝胶电泳分析ＤＮＡ 断裂；③流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果 ＰＳＳ使皮质神经元存活率增加，使ｍａｓｔｏｐａｒａｎ 引起的细胞核固缩、凝聚和断裂现象消失；ｍａｓｔｏｐａｒａｎ 使神经元的ＤＮＡ电泳图谱出现明显的“梯子状”，而ＰＳＳ使此现象消失；ｍａｓｔｏｐａｒａｎ使神经元的流式细胞仪分析图上出现明显的凋亡峰，ＰＳＳ可使此凋亡峰消失。

阿司匹林对大鼠局灶性脑缺血的保护作用及其机制

目的 探讨阿司匹林对大鼠局灶性脑缺血的保护作用及其机制。方法 利用大鼠大脑中动脉梗塞的模型，观察阿司匹林对缺血大鼠的行为障碍，脑梗塞面积，细胞凋亡峰，细胞内钙及血浆Ｃ反应蛋白的影响。结果 阿司匹林能明显改善行为障碍，显著降低缺血大鼠的脑梗塞面积，降低细胞凋亡峰，细胞内钙水平和血浆Ｃ反应蛋白。结论 阿司匹林对大鼠局灶性脑缺血具有保护作用，而且其作用机制与抗凋亡。

鲤鱼精巢DNA对果蝇和小鼠寿命的影响

目的研究鲤鱼精巢ＤＮＡ对动物寿命的影响。方法采用黑腹果蝇和ＮＩＨ小鼠作实验对象，于果蝇培养基或小鼠饮水中掺入一定浓度的鲤鱼精巢ＤＮＡ，每天观察动物生活状况，并记录动物死亡情况，将实验结果作统计学处理并进行组间ｔ检验；绘出动物的时间－存活率曲线（即存活曲线）。结果鲤鱼精巢ＤＮＡ使果蝇和小鼠的最小寿命、半数存活时间、平均存活时间、最大寿命都得以延长；ＤＮＡ给药组动物的存活曲线越位于空白对照组动物的存活曲线的右侧。结论鲤鱼精巢ＤＮＡ可明显延长果蝇和小鼠的寿命。

一种神经元体外缺氧诱导凋亡模型的建立

目的:在不改变细胞生长环境条件下,建立一种体外培养大鼠皮层神经元缺氧诱导细胞凋亡模型。方法:取新生鼠培养第8d的皮层神经元,采用不改变原培养基成分,将细胞置于缺氧环境(密闭容器内,抽取成真空并维持30min,然后充95%N2、5%CO2)中分别培养0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0和24h后,于不同时间取出,Hochest33258神经元核染色观察凋亡小体及凋亡细胞核,抽提DNA琼脂糖电泳检测DNA梯形条带,以明确导致皮层神经元凋亡的缺氧时间。结果和结论:缺氧0.5h后即可见DNA梯形条带形成,缺氧1h后即可见神经元细胞核固缩、细胞核凋亡小体形成。在不改变细胞培养基及其它成分的条件下,平均缺氧1h即可诱导体外培养的神经元细胞凋亡,成功地建立起一种体外培养大鼠皮层神经元缺氧诱导神经元凋亡模型,而且重复性好,可以作为体外缺氧/缺血诱导神经元凋亡的良好平台。

YZ-2蛋白的生物信息学分析及其多克隆抗体制备

目的:生物信息学分析与脑缺氧密切相关的新蛋白质YZ-2,以及制备其多克隆抗体。方法:根据生物信息学分析预测出YZ-2蛋白质的二级结构、亲水性、抗原性等理化特性,以这些分析预测为依据,经过同源性检索后设计出一段由22个氨基酸组成的多肽,免疫家兔得到多克隆抗体,并用ELISA、Westernblot等方法鉴定其特异性和滴度。结果:①成功分析预测其抗原性和亲水性;②制备了抗YZ-2蛋白多克隆抗体;③以此多克隆抗体经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹,检测YZ-2蛋白的表达,证实此抗体效价较高、特异性强。结论:利用生物信息学较好地预测出YZ-2的亲水性和抗原性,并成功制备了其较高特异性的多克隆抗体。

海蛾提取物对小鼠免疫器官重量和抗应激能力的影响

海蛾提取物使氢化可的松或环磷酰胺所致免疫低下小鼠的脾脏重量和胸腺重量增加,使老龄小鼠胸腺重量增加;海蛾提取物显著延长小鼠在常压缺氧或氰化钾所致化学性缺氧条件下的存活时间,对小鼠冰水中游泳存活时间也有显著的延长作用,并可明显提高小鼠耐饥渴能力。

米诺环素抑制MPP^+诱导的PC12细胞凋亡和线粒体功能损伤

目的:探讨米诺环素(minocycline)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的PC12细胞凋亡和线粒体功能损伤的保护作用。方法:将MPP+加入体外培养的的PC12细胞中,建立多巴胺能神经元凋亡模型,实验过程中用minocycline进行预处理,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)检测细胞存活率,Hoechst染色检测细胞凋亡,DCFH-DA检测ROS聚集,JC-1检测细胞线粒体膜电位变化。结果:0.5 mmol/L MPP+处理PC12细胞24 h,能明显抑制细胞生长(抑制率80.8%),诱导细胞发生凋亡(凋亡率5.22%),同时ROS浓度提高230.0%,线粒体膜去极化(绿/红荧光强度比为11.95)。而加入10μmol/L minocycline预处理30 min可明显升高MPP+处理的PC12细胞活性,细胞凋亡率明显降低(P<0.01),ROS浓度明显下降,绿/红荧光强度比也明显降低(P<0.01)。结论:Minocycline抑制MPP+诱导的PC12细胞凋亡部分通过对抗其线粒体功能而发挥作用。

大鼠脑缺血后脑组织tPA和PAI-1蛋白的表达

为了探讨鼠脑缺血后脑内组织型纤溶酶原激活物 ( t PA)及其主要抑制物 - 1型 ( PAI- 1)蛋白的表达。制备了大鼠全脑和局灶性脑缺血模型 ,用免疫组化法检测 t PA和 PAI- 1蛋白的表达。结果发现 ,在全脑、局灶性脑缺血不同时间和正常鼠脑膜、脉络膜、室管膜、血管内皮等部位均有 t PA、PAI- 1免疫阳性信号 ,但小脑、海马区未见该信号。局灶性脑缺血 6 h,缺血侧中心部位的胶质细胞和梗死灶周边的缺血半影区的神经元也显示 t PA强阳性信号 ,但该细胞不表达 PA I- 1蛋白 ;缺血 18h鼠缺血侧未见t PA、PAI- 1阳性信号。本研究提示 ,脑缺血后鼠脑组织和正常脑组织均有 t PA、PA I- 1蛋白表达 ,但全脑缺血后和正常对照鼠t PA蛋白表达无明显变化 ,而局灶性脑缺血 6 h鼠缺血侧比正常侧 t PA蛋白表达增高 ,脑缺血后鼠脑组织和正常鼠 PA I-

LY294002对热预处理抗低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡的影响

【目的】观察磷酸肌醇3位羟基激酶(PI3-K)的特异性阻断剂LY294002对热预处理抗低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元(CGN)凋亡的影响。探讨磷酸肌醇3位羟基激酶/AKT(PI3-K/AKT)信号转导通路是否参与了热预处理的保护作用及其机制。【方法】以低钾诱导的大鼠小脑颗粒神经元凋亡为模型。用相差显微镜观察形态学,DNA琼脂糖凝胶电泳和Hoechst33258核染色分析神经元凋亡,二乙酸荧光素(FDA)染色法检测细胞的存活率。蛋白质印迹(Westernblot)法检测蛋白的表达。【结果】热预处理(44℃,1h)可以保护低钾诱导的CGN的凋亡,使神经元存活率由(33.2±4.1)%上升至(76.1±5.6)%(P <0.01),核染色出现的核固缩和凋亡小体减少,DNA凝胶电泳DNA梯状条带明显减弱。LY294002(20μmol/L)可以明显抑制热预处理的保护作用,使神经元的存活率降至(37.4±3.5)%(P<0.01),核染色出现的核固缩和凋亡小体,DNA凝胶电泳出现梯状条带。热预处理可使HSP70、磷酸化AKT增高。LY294002可以抑制磷酸化AKT(p-AKT)的增加,而对HSP70则无明显影响。【结论】在低钾诱导CGN凋亡的模型中,LY294002可以抑制热预处理的抗凋亡作用,并可抑制p鄄AKT的增加,显示PI3鄄K/AKT信号转导通路参与了热预处理的保护作用,但该抑制作用可能不是通过抑制热休克蛋白(HSP)

小檗碱及其亲脂性衍生物抑制恶性胶质瘤C6细胞的增殖及迁移与侵袭

【目的】考察小檗碱及其亲脂性衍生物对大鼠C6胶质瘤细胞增殖、迁移与侵袭的影响。【方法】合成四种小檗碱衍生物9-O-十二烷基小檗碱(B3)、9-O-十六烷基小檗碱(B4)、9-O-十八烷基小檗碱(B5)、9-O-苄基小檗碱(B6)。采用1H NMR、13C NMR及ESI-MS确证其结构。四唑盐(MTT)比色法检测化合物在不同浓度下作用24、48、72 h后对C6细胞增殖活性的影响;细胞划痕实验和transwell迁移实验检测对细胞迁移能力的影响,transwell侵袭实验检测对细胞侵袭能力的影响。【结果】MTT结果显示,衍生物抑制细胞增殖作用显著强于对照组与小檗碱组(P<0.05);其中,B3的抑制作用最强。划痕实验、transwell迁移与侵袭实验结果显示,与对照组比较,小檗碱及其衍生物能明显抑制C6细胞的迁移与侵袭(P<0.05);其中,B3与B4抑制作用最强。【结论】小檗碱的亲脂性衍生物能有效地抑制C6胶质瘤细胞的增殖、迁移与侵袭,为开发新的恶性胶质瘤治疗方法提供新的思路。

Bcl-2蛋白对环匹阿尼酸诱导CHO细胞凋亡的保护作用

Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色和ＤＮＡ电泳分析揭示了内质网钙泵抑制剂环匹阿尼酸（ＣＰＡ）呈浓度依赖性地诱导ＣＨＯ细胞凋亡，表现出染色体固缩和ＤＮＡ片断形成的典型特征．Ｂｃｌ－２的过度表达对ＣＰＡ诱导的ＣＨＯ细胞凋亡具有保护作用．采用Ｆｕｒａ－２技术测定细胞内游离钙浓度（［Ｃａ２＋］ｉ）变化，观察到Ｂｃｌ－２对ＣＰＡ触发的细胞Ｃａ２＋库Ｃａ２＋释放无任何影响．结果表明Ｂｃｌ－２蛋白对ＣＰＡ诱导的ＣＨＯ细胞凋亡的保护作用不是通过抑制ＣＰＡ诱导的Ｃａ２＋释放。