特异性导向肝细胞表达和复制的EB病毒载体系统的组建

发展了一种高效的、能将携带外源基因的质粒型ＥＢ病毒载体特异性地导入肝细胞表达的方法。将ＥＢ病毒复制子载体ｐＤＲ２经改造得到携带外源基因的ｐＥＢｌｕｃ质粒。将ｐＥＢｌｕｃ与人工制备的、既保留了ＤＮＡ结合活性又能为肝细胞受体识别并内在化的半乳糖基化组蛋白的ｆｌ组分结合，形成ｐＥＢｌｕｃ－半乳糖基化组蛋白复合物。该复合物通过脱唾液酸糖蛋白受体介导的内吞进入肝细胞并表达。ｐＥＢｌｕｃ质粒在细胞内能稳定存在并自主复制。该系统具有应用于以肝细胞为靶组织的基因治疗的前景。

胞外弹性蛋白酶产生菌的筛选及酶的纯化

从土壤中筛选到132株能分泌胞外弹性蛋白酶的细菌,经复筛得5株产酶在100u/ml以上,其中No.17-87菌每毫升发酵液含酶120单位,经鉴定为芳香黄杆菌。该菌在26℃发酵21小时酶产量即达峰值。从发酵液中分离纯化得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的酶制品。SDS-PAGE测得分子量为21300,最适作用温度为50℃,最适作用pH为7.4,在pH4.5—9.5范围内稳定,重金属离子Fe^(3+)、Zn^(2+)、Cu^(2+)、Cr^(3+)、CO^(2+)、Ni^(2+)、Hg^(2+)和Ag^+等严重抑制酶活性。

微生物发酵生产药用弹性蛋白酶

综述应用微生物技术生产弹性蛋白酶的研究概况,并结合作者的工作展望了以发酵法取代脏器提取法生产该药用酶的可行性和优越性。

弹性蛋白酶和木瓜蛋白酶对不同蛋白质水解能力的比较

目前,作为肉类嫩化剂的主要成分——蛋白水解酶是采用来源于番木瓜(Carica pspayaL．)乳的木瓜蛋白酶(Papain)。作者在科研中,分离筛选出一株弹性蛋白高产菌(Flavobacteri－urn SP17—87),所产胞外弹性蛋白酶(elastase)

以粘粒为基础产生重组单纯疱疹病毒HSV1-lacZ的研究

将总长度为１５２ｋｂ的单纯疱疹病毒１型（ＨＳＶ－１）（１７株）基因组分成５个相互间有部分重叠的大片段（约３５－４０ｋｂ），分别克隆到粘粒ＳｕｐｅｒＣｏｓＭＷ中，依次称为ｃｏｓ４８、ｃｏｓ２８、ｃｏｓ６、ｃｏｓ１４和ｃｏｓ５６（ＤａｖｉｓｏｎＡＪｅｔａｌ，１９９３）。此５个粘粒用ＰａｃⅠ切去粘粒骨架后共转染细胞，可发生同源重组而产生野生型ＨＳＶ－１。以此为基础，利用粘粒ｃｏｓ５６的ＨＳＶ－１ＵＬ４４基因中含有一个ＸｂａⅠ单一酶切位点的特点，将一个两端加有ＸｂａⅠ位点的ＣＭＶ－ｌａｃＺ－ｐｏｌｙＡ片段插入其中，构建成ｃｏｓ５６－ｌａｃＺ。将ｃｏｓ５６－ｌａｃＺ与其它４个粘粒经ＰａｃⅠ酶切后，用ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ转染试剂共转染ＢＨＫ－２１细胞，３７℃培养２－３天，开始出现细胞病变及噬斑。５天后将病变细胞连同培养液一起冻融３次，取上清０．１ｍｌ感染新鲜的ＢＨＫ－２１细胞，３７℃培养２４小时，用Ｘ－ｇａｌ染色３０－６０分钟，镜下观察可见大量蓝色噬斑。蓝色噬斑数占噬斑总数的５０％以上。经空斑纯化的蓝斑病毒可稳定传代。这种方法同将外源基因表达盒插入ＨＳＶｔｋ基因中构建成重组质粒，再与ＨＳＶ－１基因组ＤＮＡ共转染细?

丙型肝炎病毒C蛋白和NS3蛋白双表位嵌合型重组抗原的表达

应用基因工程技术构建了两种可表达丙型肝炎病毒Ｃ蛋白和ＮＳ３蛋白双表位嵌合抗原Ａ（Ｃ７５－ＮＳ３ａ）和Ｂ（ＮＳ３ａ－Ｃ７５）的质粒，并在大肠杆菌中进行了表达。采用经过盐析和离子交换层析纯化的表达产物进行Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹、抗Ｃ和抗ＮＳ３双抗体夹心ＥＬＩＳＡ试验，并用以检测Ｃ或ＮＳ３表位单特异性血清及系列血清，结果表明Ａ或Ｂ抗原均同时具备Ｃ和ＮＳ３抗原的免疫反应性，而且两种抗原的性能基本相似。在ＨＣＶ抗体检测中这类抗原可望替代配伍的Ｃ＋Ｃ３３ｃ混合抗原。

单纯疱疹病毒Ⅰ型扩增子质粒载体的构建及LacZ基因的表达

从单纯疱疹病毒Ⅰ型ＨＳＶ－１基因组中分离出其包装信号序列，与含ＨＳＶ－１复制起点及ＩＥ－６８基因启动子的ＤＮＡ序列、β半乳糖苷酶基因和大肠杆菌质粒骨架，构建了一种ＨＳＶ－１扩增子质粒载体ｐＨＳＬ，其中ＬａｃＺ基因置于ＩＥ－６８基因启动子控制下。将此质粒转染已感染了ＨＳＶ－１温度敏感株ｔｓＫ株的Ｖｅｒｏ细胞，ｐＨＳＬ可在ＨＳＶ－１ｔｓＫ的辅助下包装成假病毒颗粒，这样就可得到同时含有假病毒和ＨＳＶ－１ｔｓＫ的混合毒株ｄｖＨＳＬ。将此混合毒株感染传代细胞和神经细胞，可在其中表达ＬａｃＺ基因，而在生理温度（３７℃）下，混合毒株的复制受到抑制。提示这种缺陷型疱疹病毒载体有用于向神经系统基因转移的可能性。

受体介导的EBV复制子载体定向导入大鼠肝脏组织中表达

在先前的体外实验中，我们利用半乳糖基化组蛋白与带荧光素酶报告基因的ＥＢ病毒复制子载体ｐＥＢｌｕｃ，在体外组建了一种核酸蛋白质复合物。它可被肝细胞表面特异存在的脱唾液酸糖蛋白（Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＳＧＰ）受体识别，并通过该受体介导的内吞作用将外源基因特异性导入培养的肝细胞素中表达。在此基础上，我们对该核酸蛋白复合物进行的电子显微镜观察表明，其大小在１００ｎｍ以内。在动物体内试验中证实了通过体液循环将此复合物靶向传递到肝组织的可能性。

利用合成肽进行丙型肝炎病毒（HCV）的线性抗原表位分析

首先利用固相多肽合成技术对ＨＣＶ多蛋白中可能含有优势抗原表位的１４个肽段进行了化学合成，并用合成肽作包被抗原进行间接ＥＬＬＳＡ试验来分析它们的抗原性，结果表明，所有合成肽中除ＮＳ３区的Ｐ７、Ｐ８和ＮＳ５区的Ｐ１３无抗原性外，其余肽段均具有抗原活性，其中Ｃ区的Ｐ１，ＮＳ４区和Ｐ９和ＮＳ５区的Ｐ１２三个肽段的抗原性较好，与相应的重组蛋白Ｃ２２，Ｃ１００和ＮＳ５Ａ比较，它们之间的抗原性比较接近，随后选择抗原性较好的几个肽段合成了含八分支的多抗原肽（ＭＡＰ）ＭＰ１、ＭＰ２、ＭＰ３、ＭＰ１０和嵌合多肽ＣＰ１５等工程肽抗原，前者不仅保持了相应单体肽的抗原性，而且与抗体反应的敏感性有显著提高；后者含双表位改善了常规合成肽抗原表位单一的缺陷，为研究ＨＣＶ工程肽抗原进行了有益的尝试。

一种通用型重组2型腺伴随病毒载体的构建及外源基因表达的研究

以野生型2型人腺伴随病毒（AAV－2）基因组载体pSSV9－int-为基础，构建了一种携带和表达真核基因的基础AAV载体pSSV9／MulV－neosv，表达了neo基因，并采用该载体组建了携带人白细胞介素-2cDNA的重组AAV载体pSSV9／MulV－neosv－IL－2，转染A549细胞后表达了人白细胞介素-2基因。为应用腺伴随病毒作基因治疗研究提供了实验基础。

芳香黄杆菌弹性蛋白酶的纯化及性质研究

报道了弹性蛋白亲和层析分离纯化芳香黄杆菌产胞外弹性蛋白酶。经一步柱层析可获聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的酶制品，收率可达５０％，并制备了酶的结晶。该酶在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上测得分子量为２１３８０，ＩＥＦ－ＰＡＧＥ测得等电点８．９，最适作用温度为５０℃，最适作用ｐＨ为７．４，在４０℃以下热稳定性良好，ｐＨ４．５－９．５范围内稳定，重金属离子Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｃｒ３＋、Ｃｏ２＋、Ｈｇ２＋、Ｎｉ２＋、Ａｇ＋、Ｃｕ２＋等严重抑制酶活性，黄杆菌弹性蛋白酶除了特异水解弹性蛋白外，对干酪素、血纤维蛋白、白蛋白、明胶、血红蛋白等多种蛋白质均能水解。

多抗原肽在抗HCV血清学诊断中的应用

应用八分支的多抗原肽（Ｍｕｌｔｉｐｌｃａｎｔｉｇｅｎｉｃｐｅｐｔｉｄｅ，ＭＡＰ）树脂，通过固相肽合成技术，合成一系列源于ＨＣＶ核心蛋白和ＮＳ４蛋白的八分支多抗原肽。经ＥＬＩＳＡ检测表明，八分支多抗原肽具有较强的免疫反应性。与相应的单拷贝寡肽相比较，多抗原肽对弱阳性血清的检出率有所提高。中和ＥＬＩＳＡ试验也表明，多抗原肽与抗体的亲合力及包被效率均优于单拷贝寡肽。多抗原肽不仅可以提高检测的灵敏度和可靠性，而且可以降低抗原的包被浓度，故在抗ＨＣＶ血清学诊断中具有一定的应用优势。

丙型肝炎病毒核心区优势抗原表位基因的化学合成及其表达产物的抗原性分析

依据丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）多蛋白核心区Ｎ端氨基酸序列和密码子简并性，人为设计并采用半化学半酶促的方法合成了一个ＤＮＡ片段。经核酸杂交检测以及ＤＮＡ序列分析证实，该片段的核苷酸序列与设计完全一致。将合成的ＤＮＡ片段插入融合表达载体ｐＧＥＸ－２Ｔ中，表达产物经亲和层析纯化后进行Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹实验和间接ＥＬＩＳＡ分析，结果表明，融合蛋白具有ＨＣＶ核心区抗原的免疫反应性，可望用于ＨＣＶ抗体的检测．此外，编码ＨＣＶ优势抗原表位的化学合成基因有可能为ＨＣＶ嵌合抗原的研究提供一条捷径。

表达β-半乳糖苷酶基因的腺伴随病毒载体构建及重组病毒包装系统的研究

表达β－半乳糖苷酶基因的腺伴随病毒载体构建及重组病毒包装系统的研究张桐１王文亮１王伯云１颜子颖２杨新科２候云德２（１第四军医大学病理学教研室西安７１００３３２中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室）关键词β－半乳糖苷酶腺伴随病毒载体...

单纯疱疹病毒I型扩增子系列载体的构建

我们先前已报道了构建成一种能在ＨＳＶｔｓＫ株辅助下进行复制和包装，并表达β－半乳糖苷酶基因ｌａｃＺ的ＨＳＶ－１扩增子质粒ｐＨＳＬ，以及它的应用〔１〕。该质粒中依次含有ＨＳＶ－１复制起点ｏｒｉＳ序列及ＩＥ６８启动子、ｌａｃＺ基因、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ、ＨＳＶ－１包装信号‘ａ’序列和大肠杆菌质粒骨架。然而，该质粒中的报告基因ｌａｃＺ无法用简单的酶切方法卸载下来，继而装入目的基因。本研究在此基础上，新构建了一系列质粒型单纯疱疹病毒载体。首先构建了ＨＳＶ－１扩增子载体质粒ｐＨＳＶＩＥ６８，在ＩＥ６８启动子的下游带有可供外源基因插入的ＨｉｎｄⅢ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ等克隆位点，其后没有ｐｏｌｙＡ加尾信号。为检验ｐＨＳＶＩＥ６８载体的有效性，将报告基因ｌａｃＺ－ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ片段通过ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨＩ位点插入该载体中，构建成重组扩增子质粒ｐＨＳＶ－ｌａｃＺ１。将该质粒转入ＢＨＫ细胞，并辅以ＨＳＶ－１ｔｓＫ株病毒感染，３１℃培养４８～７２小时后收获的细胞上清感染新鲜的ＢＨＫ细胞，用Ｘ－ｇａｌ液染色可见有大量细胞蓝染，提示所构建的ｐＨＳＶＩＥ６８质粒能有效地工作。在此基础上，我们又构建了含有ＳＶ４０ｐｌｏｙ?

微生物产弹性蛋白酶研究进展

弹性蛋白酶(Elastase)是一种以分解不溶性弹性蛋白为特征的广谱蛋白水解酶,具有重大的经济和应用价值。目前,弹性蛋白酶主要作为治疗高血脂症、防治动脉粥样硬化症的生化药物,疗效确切,安全可靠。

β－半乳糖苷酶基因的腺伴随病毒（AAV－2）载体的构建及其在哺乳类细胞中的表达

以野生型２型人类腺伴随病毒（ＡＡＶ－２）全基因组载体（ｐＳＳＶ９和ｐＳＳＶ９－ｉｎｔ－）为基础，构建了重组ＡＡＶ载体ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）和ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－），制备ＡＡＶ重组病毒，感染宿主细胞后表达了β－半乳糖苷酶基因。此外，用脂质体转染法将载体导入２９３细胞和Ａ５４９细胞，进行了ＬａｃＺ基因瞬时表达研究。结果显示，重组ＡＡＶ载体（ＰＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋））ＬａｃＺ基因表达的动态变化特点是，转染后表达较早（１２～２４ｈ）出现，并迅速达到高峰值（经２４ｈ），随后较快下降（经４８～７２ｈ）并维持在较低水平。将启动子附近ｉｔｒ结构有差别的上述两载体转染宿主细胞７２ｈ后做表达水平比较，结果ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－）在２９３细胞和Ａ５４９细胞中，ＬａｃＺ表达水平均高于ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）（１．２倍～１．４倍），提示启动子附近ＡＡＶｉｔｒ结构的变异对表达有一定的影响。

实验动物模型旋转监测仪的研制

介绍的动物旋转监测仪采用单片机技术，可通过四个测试通道，准确的自动检测和记录多种动物模型的旋转情况。根据各实验室的不同要求，本仪器提供了四种检测方式，并能对检测的推进行智能化处理。

肝细胞导向的促血小板生成素基因转移对化疗后血小板减少症模型治疗的初步研究

为了探讨受体介导的基因转移技术在治疗血小板减少症方面应用的可行性，将促血小板生成素（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＴＰＯ）基因克隆入质粒型ＥＢ病毒表达载体ｐＤＲ２中，并与半乳糖化组蛋白结合，从而制备了一种为肝细胞表面特异的脱唾液酸糖蛋白受体识别并内吞的核酸－蛋白复合物。在经化疗药物卡铂诱发的血小板减少症的实验动物大鼠中，同时静脉注射该复合物，可将ＴＰＯ基因特异地导入肝细胞并在其中得到表达。从而有效地阻止了血小板减少症的发生。