猪繁殖与呼吸综合征检测与监测技术要点

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)引起的一种严重危害全球养猪生产的传染病,其主要危害是引起母猪繁殖障碍和生长猪呼吸道疾病以及发病猪群的继发感染。

1株欧亚类禽猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析

【目的】了解广东地区猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)的流行情况并探究其分子生物学特征。【方法】采集广东某猪场疑似猪流感病毒感染猪的鼻拭子和肺脏组织样品进行病毒分离鉴定、遗传进化和关键氨基酸位点分析。【结果】样品经实时荧光定量RT-PCR检测为猪流感病毒核酸阳性;在红细胞凝集试验中,该病毒对鸡红细胞有凝集作用,血凝效价为1∶128;8个基因片段序列结果经BLAST比对和进化树分析显示,HA、NA基因属于欧亚类禽猪流感病毒(H1N1)分支,PA、PB 1、PB 2、NP和M基因属pdm/09分支,NS基因属于北美三源重组分支,因此,本试验分离株属于G4基因型欧亚类禽猪流感病毒,将其命名为A/swine/Guangdong/CJM2/2022(H1N1)。关键氨基酸位点分析显示,分离株HA蛋白裂解位点序列为PSIQSR/GL,具有典型低致病性流感病毒的分子特征。HA基因在受体结合位点处的190、225、226位氨基酸分别为D、E、Q,表明其既具有结合人型唾液酸受体的潜能又具有结合禽型唾液酸受体的潜能。NA基因关键氨基酸残基均未发生突变,提示分离株对奥司他韦和扎那米韦等神经氨酸酶抑制剂的敏感性较高,而M基因3处氨基酸位点突变为V27A、A30T、D44A,提示对金刚烷胺类药物耐药性增加。【结论】本研究分离鉴定的毒株为G4基因型欧亚类禽猪流感病毒,关键氨基酸位点分析提示该毒株具有适应在哺乳动物中复制和毒力增强的特征。本研究结果为广东地区猪流感的防控提供了参考数据。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV-2)快速检测方法,根据ENTV-2 env基因保守区域设计引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,该方法建立的标准曲线在重组质粒浓度为1.019×10^(9)—1.019×10^(2)copies/μL时,相关系数R^(2)为0.998,Ct值和重组质粒浓度有良好的线性关系;与相关的其他5种羊常见病原无交叉反应,最低检测限度为10.19 copies/μL,组间和组内的变异系数均在1.5%内。利用本研究建立的方法与常规RT-PCR对20份临床样品进行对比检测,两种方法的ENTV-2阳性检出率分别为60%(12/20)和30%(6/20),两种方法的总符合率为70%(14/20)。结果表明,本研究建立的方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为ENTV-2的诊断和流行病学调查提供技术手段。

鳜源维氏气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

从发病鳜鱼中分离到1株优势菌(ZQ202010),进行剖检、细菌分离培养、革兰氏染色、生化鉴定、16S rRNA及gyr B基因测序、动物致病性试验、毒力检测和药敏试验。结果显示,分离株ZQ202010为革兰氏阴性小杆菌,具有运动性,该分离菌赖氨酸脱羧酶、氧化酶、VP、吲哚等反应呈阳性;精氨酸水解酶、硫化氢等反应呈阴性;16S rRNA及gyr B基因序列与维氏气单胞菌同源性均大于99%,且在系统进化树上与维氏气单胞菌处于同一分支;动物致病性试验表明分离株对鳜鱼有较强的致病性,对鳜鱼的半数致死量为4.09×10^(6) CFU,毒力检测显示分离菌携带aer A、alt、fla、exu、ser、ahy B和lip共7个毒力基因,说明分离菌具有较强毒力。分离菌对头孢拉定、替米考星、头孢曲松、氟苯尼考、强力霉素等药物敏感,对环丙沙星、头孢噻肟、青霉素、阿莫西林/克拉维酸、恩诺沙星、复方磺胺甲噁唑、利福平和氧氟沙星等8种药物耐药。研究结果可为鳜源维氏气单胞菌的防控提供依据。

猪流感病毒广东株分离鉴定及遗传进化分析

本研究从广东省某猪场采集37份疑似猪流感症状的猪鼻拭子样品,接种于9日龄SPF鸡胚并收集尿囊液,通过血凝试验、血凝抑制试验和RT-PCR鉴定,分离得到一株猪流感病毒,经RT-PCR分别扩增8个基因片段,进行基因测序及序列分析,与GenBank收录的参考毒株比对并构建进化树。结果显示,分离毒株为H1N1亚型猪流感病毒,将其命名为A/swine/Guangdong/2/2018(H1N1)。遗传进化分析显示,分离株8个片段的核酸序列与A/swine/Guangdong/L3/2009(H1N1)对应序列的同源性均达99%以上,与经典型H1N1亚型猪流感病毒处于同一分支。分离毒株HA的裂解位点为PSIQSR↓GL,符合低致病性流感病毒分子特征。HA基因受体位点为190D、225G和226Q,表明本毒株既可以结合SAα-2,6-Gal型人类流感病毒SA受体,也有结合SAα-2,3-Gal型禽类流感病毒SA受体的可能,在28、40、104、304、498、557位氨基酸处有6个潜在糖基化位点;NA蛋白在50、58、63、68、98、146、235位氨基酸处有6个潜在糖基化位点,NA蛋白氨基酸序列活性中心位点为119E、199D、223I、275H、293R、295N,氨基酸分析位点未出现突变,表明本分离株对神经氨酸酶抑制剂类药物的敏感性较高,但在M2蛋白中,31位氨基酸由敏感型的(S)突变为抗药的(N),提示可能对金刚烷胺类药物产生耐药性。开展猪流感病毒分离鉴定与遗传进化分析将为广东地区的猪流感流行和变异情况提供重要信息。

猪源马链球菌兽疫亚种分离鉴定

为确诊广东省江门市某规模化猪场保育仔猪发生脑膜炎死亡的病因,本研究通过临床解剖观察、细菌分离培养、革兰染色镜检、溶血性观察、生化鉴定、小鼠毒力试验和药敏试验、16S rRNA及M蛋白(SzP)基因序列分析进行鉴定。结果:从发病猪脑顶叶分离到1株致病菌,命名为SEZ20180618,分离菌在鲜血平板上生长出微隆起、圆滑湿润的小菌落,呈β溶血,革兰染色阳性、呈链状排列的球菌;16S rRNA基因序列分析显示,分离菌与马链球菌兽疫亚种处于同一分支,同源性在97%以上;SzP氨基酸序列与马链球菌兽疫亚种CT株、Cxy012株、SH00166株等参考菌株的相应序列同源性为100%。分离菌株SEZ20180618对BALB/c小鼠具有较强的毒力,对BALB/c小鼠的半数致死量为1.54×10^(6 )CFU;分离菌对阿莫西林、青霉素、庆大霉素等14种临床常用抗菌药物均敏感,对阿米卡星和复方新诺明2种药物中度敏感。

一株血清5型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

广东省某规模猪场保育猪突然发生散发性死亡,为了探究其死亡原因,通过流行病学调查、猪群临床表现和病猪病理变化作出初步诊断后,对可疑病毒进行实验室检测,同时进行细菌分离培养、生化鉴定、16S rRNA基因测序分析、血清型鉴定和药敏试验。结果显示,未检测到相关病毒,另外分离到一株革兰阴性短杆菌,在麦康凯培养基和普通琼脂培养基上均不生长,在V因子血平板呈现白色半透明细小露珠状菌落,具反光特性,不溶血;16S rRNA基因序列分析表明,分离菌株与副猪嗜血杆菌处于同一分支,同源性>99%,综合血清型鉴定结果,判定分离菌为血清5型副猪嗜血杆菌;药敏结果显示该菌对头孢拉定、氨苄西林等12种抗生素敏感。本试验从病猪中分离到1株血清5型HPS,并根据药敏试验结果进行治疗,取得了良好的治疗效果。

microRNA-124-3p调控H1N1亚型猪流感病毒致小鼠肺损伤的研究

为研究microRNA-124-3p(miR-124-3p)对H1N1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)感染小鼠所致肺损伤的调控作用,本试验构建miR-124-3p腺病毒表达载体,通过小鼠尾部静脉注射法构建miR-124-3p差异表达小鼠模型,试验分3组:过表达组、抑制组和对照组。48 h后,各组小鼠鼻腔接种H1N1亚型SIV,每只105 EID50(50μL)。连续观察14 d,计算小鼠平均体重变化率、观察病理切片并测定相关炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA相对表达量。结果显示,已成功将pre-miR序列及其sponge序列插入腺病毒的穿梭质粒,并将其共转染293A细胞。实时荧光定量PCR检测证实,与对照组相比,过表达组和抑制组小鼠黑色素瘤细胞miR-124-3p表达水平分别极显著升高(P<0.01)和显著降低(P<0.05),表明成功构建腺病毒表达载体。过表达组、抑制组和对照组小鼠体重变化率分别为-5.5%、-12.4%和-8.6%。抑制组和对照组均可见肺泡壁增厚,其间有多量淋巴细胞浸润,部分肺泡内出现纤维蛋白渗出,且抑制组病理变化更为严重,肺泡中还有大量的红细胞浸润;而过表达组仅有少量的淋巴细胞浸润,肺脏组织较正常。与对照组相比,过表达组检测的炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA表达水平均显著降低(P<0.05);抑制组炎症相关炎症因子mRNA表达水平均显著升高(P<0.05)。本试验结果表明,miR-124-3p对H1N1亚型SIV感染小鼠所致的肺脏炎症因子的表达具有抑制作用,同时能减轻肺脏病理损伤。

新疆旱獭肠道RNA病毒的宏转录组学研究

目的了解新疆地区旱獭(Marmota)肠道携带RNA病毒的病原本底。方法采用宏转录组学方法对新疆喀什地区14只健康旱獭肠道样品进行病毒组分析。结果基于重叠序列(contig)水平共注释到5个脊椎动物病毒科,分别为星状病毒科、小RNA病毒科、呼肠孤病毒科、圆环病毒科和腺病毒科。根据病毒宏转录组学结果,对注释到的病毒进行检测与进化分析,发现心病毒、嵴病毒、摩萨病毒与参考毒株同源性较高,为这些病毒变异株,而肠道病毒、腺病毒与已知病毒具有明显的遗传差异,可能为该病毒新种;星状病毒与其他旱獭源星状病毒之间氨基酸同源性差异较大,显示星状病毒在旱獭体内具有遗传多样性。值得注意的是,旱獭轮状病毒与牛轮状病毒核苷酸同源性高达92%,表明该病毒可能经过粪口途径实现跨种传播。结论该研究揭示了旱獭肠道携带RNA病毒的多样性,为了解旱獭病毒本底、监测病毒传播生态链提供了重要数据。

广东省1株猪16型链球菌的分离鉴定及药敏试验

为了确定引起广东省江门市某规模化猪场仔猪死亡的原因,试验采集病猪心脏、脾脏、肺脏、关节液、脑、淋巴结等组织进行病毒检测和细菌分离鉴定,并对分离菌进行纯化培养、革兰氏染色、生化鉴定、菌种鉴定及测序分析、血清型鉴定、毒力基因检测、动物试验及药敏试验。结果表明:分离株在鲜血营养琼脂上生长良好,呈α溶血,镜检可见革兰氏阳性球菌,呈典型链状排列;生化特性与猪链球菌相符;PCR扩增得到大小为1 500 bp和688 bp的目的条带,分离株与猪链球菌同源性大于99%,在系统进化树上与猪链球菌处于同一分支,为16型猪链球菌;该分离菌毒力因子基因型为fbps^(+)/orf^(+)/sly^(+)/gapdh^(+)/epf^(+)/mrp^(+),可致NIH小鼠死亡,毒力较强;分离菌对阿莫西林/克拉维酸、青霉素、头孢噻肟、头孢拉定、头孢曲松、庆大霉素、大观霉素、恩诺沙星和氟苯尼考9种药物敏感,对新霉素、复方磺胺甲口恶唑、强力霉素和替米考星4种药物耐药。选用阿莫西林进行群体治疗,取得了很好的效果。说明该猪场仔猪感染了16型猪链球菌,青霉素类抗菌药物可用于临床治疗。

microRNA-124-3p对Th17细胞体外分化的影响分析

为探讨microRNA-124-3p(miR-124-3P)对Th17细胞体外分化的影响,本研究通过密度梯度离心获取小鼠脾脏单淋巴细胞悬液,运用免疫磁珠法分选幼稚T细胞,然后用腺病毒表达载体转染幼稚T细胞,介导miR-124-3P过表达和抑制表达,并设空白对照组,加入Th17细胞分化相关细胞因子,诱导幼稚T细胞向Th17细胞方向极化,运用流式细胞术检测极化后的Th17细胞占比,并用ELISA方法检测细胞培养上清中白细胞介素-17A(IL-17A)浓度。结果表明免疫磁珠法纯化幼稚T细胞纯度>90%;miR-124-3P过表达腺病毒载体转染幼稚T细胞,可显著提高miR-124-3P的表达量(P<0.05);流式细胞术和ELISA检测结果均表明,相比较空白对照组,过表达miR-124-3p可显著抑制Th17细胞体外分化,而抑制miR-124-3P表达可显著促进Th17细胞体外分化。研究表明,miR-124-3p对Th17细胞体外分化具有重要调控作用。