截短的人精子特异性乳酸脱氢酶L178X突变体丧失催化活性

精子特异性乳酸脱氢酶(乳酸脱氢酶C4,LDH-C4)是精子能量代谢的关键酶类之一.为了研究前期发现的1个LDH-C4基因突变(L178X)对LDH-C4功能的影响,在已构建的LDH-C4原核表达载体pET-28a(+)-hLDHC的基础上,利用PCR定点诱变技术,制备了L178X突变体的原核表达载体pET-28a(+)-hLDHC/L178X,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS,诱导其表达.对该载体进行限制性酶切表明,插入的LDHC基因cDNA约1000bp;序列分析表明,该插入片段读框正确,带L178X突变.SDS-PAGE及免疫印迹显示,携带该载体的菌体可表达分子量约25kD的蛋白质,后者可被兔抗LDH-C4血清特异识别.乳酸脱氢酶(LDH)活性测定及活性染色表明,所表达的产物没有LDH活性.本研究成功进行了LDH-C4的1个突变体的原核表达,为研究LDHC基因突变对LDH-C4功能以及男性生育的影响奠定了基础.

不明原因男性不育人群中睾丸特异性乳酸脱氢酶基因突变的发现及其意义

为了研究睾丸特异性乳酸脱氢酶,即乳酸脱氢酶C4(LDH-C4)基因突变在男性不育发病中的作用,利用LDH-C4特异性底物对100名不明原因男性不育症患者的精子LDH-C4进行活性显色,用变性高效液相色谱(DHPLC)技术对LDH-C4活性低下的患者进行LDHC基因PCR产物的突变筛查,对DHPLC峰形异常的PCR产物进行序列测定.筛选到一组精子LDH-C4活性明显下降的患者,其中1名患者的LDHC基因PCR产物在DHPLC中呈异常洗脱峰.对这一PCR产物进行序列测定,发现患者LDHC基因第5外显子的115位碱基发生了T→A的杂合改变(GenBank登录号GU479375),该突变使LDHC基因的178位密码子由原来的TTG(编码亮氨酸)变为TAG(终止密码子),形成截短的C亚基.T克隆-测序进一步证实了该无义突变的杂合状态.这是在人类LDHC基因上发现的第一个突变,提示LDHC基因突变可能是男性不育发病的原因之一.

免疫透射比浊法检测CRP部分性能指标评价

目的对免疫透射比浊法测定C反应蛋白(CRP)部分性能指标进行评价。方法用免疫透射比浊法测定血清CRP,依据美国临床实验室标准化协会(CLIS)文件要求进行精密度、线性范围评价,并与免疫散射比浊法进行比较。结果 CRP在3.14、6.70mg/L时,总不精密度分别为3.45%和2.21%,均小于CLIA′88规定的允许误差范围的1/2(10%);免疫透射比浊法测定血清CRP在0.12～410mg/L范围内线性良好,相关方程为Y=1.010 9 X-0.086 1;与西门子BNII全自动特定蛋白分析仪免疫散射比浊法比较,回归方程为Y=0.968 1 X+0.600 6,r=0.993 3(P<0.01)。结论免疫透射比浊法检测CRP重复性好、线性范围宽,与免疫散射比浊法具有很好相关性,操作简单,检测速度快,完全符合急诊检测的需要。

胃泌素释放肽前体在小细胞肺癌中的诊断与疗效监测分析

目的研究对小细胞肺癌的患者使用胃泌素释放肽前体进行诊断和临床治疗效果监测的意义。方法该研究主要采取回顾性分析方法,对2015年2月—2016年2月该院住院的45例小细胞肺癌(SCLC)患者和45例非小细胞肺癌(NSCLC)使用电化学发光免疫分析法对患者的血清进行分析,分析患者在接受治疗前后体内的血清数值变化。结果胃泌素释放肽前体(Pro GRP)在SCLC中高于NSCLC,组件比较差异有统计学意义,且在接受治疗后患者的治疗效果越好,其血清内的Pro GRP数值下降的越多。Pro GRP、NSE、CEA、CYFRA21-1的敏感性分别为87.63%、66.36%、21.95%、58.91%,特异性分别为95.74%、84.62%、72.36%、89.68%。结论Pro GRP可作为SCLC患者首选的肿瘤血清标记物,并且其数值的变化可用于观察患者的病情是否得到控制。

人精子特异性乳酸脱氢酶结构和功能的计算生物学分析

精子特异性乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH),又称乳酸脱氢酶C4(lactate dehydrogenase C4,LDH-C4),特异性地存在于哺乳动物发育成熟的睾丸组织中,与精子的生成、代谢、获能等有密切关系.根据GenBank数据库中人LDH-C4氨基酸序列(P07864),利用PROSITE数据库预测人LDH-C4的功能基序;利用Clustalw2、TreeView1.6.6进行LDH-C4进化树的构建;利用I-TASSER软件预测人LDH-C4的二、三、四级结构以及功能位点.结果表明:在190!196位有1个LDH活性位点,该位点为脊椎动物各亚型乳酸脱氢酶共有的催化位点,为进化中的1个保守序列;从进化树来看,LDHC和LDHB的亲缘关系比较近;人LDH-C4与小鼠LDH-C4的二级、三级结构具有很高的相似性;LDH-C4属乳酸脱氢酶-苹果酸脱氢酶(LDH-MDH)超家族中的LDH-1(cd05293)家族的成员,属于NAD依赖性酶,拥有LDH-1家族具备的基本结构特点.以上结果为研究LDH-C4基因突变对其功能的影响打下基础.

国产细胞角蛋白19片段CYFRA21-1化学发光定量检测试剂盒的性能评估

目的对厦门万泰凯瑞生物技术有限公司的细胞角蛋白19片段非小细胞肺原相关抗原21-1（CYFRA21-1）化学发光定量检测试剂盒进行分析性能评估。方法依据《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则》等文件对试剂盒的敏感性、线性范围、可报告范围、准确度、精密度、交叉反应等性能进行评估,同时与电化学发光法平行比对,检测配对血清/血浆结果的一致性。结果该试剂盒检测最低限为0.1ng/mL;线性范围为0.1-1 000.0ng/mL;可报告范围达0.1-2 000.0ng/mL;批内精密度为6.15%-9.46%,批间精密度为7.57%-11.00%;回收率达99.60%;与多种常见肿瘤抗原无交叉反应;轻度溶血、胆红素小于或等于340μmol/L、三酰甘油小于或等于18.1μmol/L及类风湿因子小于或等于400U/mL时,对试剂无显著干扰;与电化学发光法检测总符合率为98.56%,一致性良好（P〈0.05,Kappa=0.965）;血清、血浆标本检测一致性良好（P〈0.05,Kappa=0.936）。结论厦门万泰凯瑞生物技术有限公司生产的细胞角蛋白19片段CYFRA21-1化学发光定量检测试剂盒各项性能评估良好,可满足临床检测要求。

一个肾上腺脑白质营养不良家系的ABCD1基因突变分析

目的通过对1例疑似肾上腺脑白质营养不良（ALD）患者及该家系其他成员进行ALD基因分析来明确诊断。方法从患者和家庭成员的外周血白细胞提取总RNA和基因组DNA；应用RT-PCR技术，首先对先证者cDNA的ABCD1基因编码区进行序列分析，寻找突变位点，再通过PCR和直接测序等方法进一步确证该突变位点；同时对该家系其他成员的相应基因组DNA进行ABCD1基因分析。结果先证者的ABCD1基因第656（G1、657（A）位碱基缺失．造成移码突变fsR89，可以确诊为ALD。该家系其他成员基因突变分析结果为：先证者表弟存在与先证者相同的突变，为ALD半合子；先证者的母亲、小姨、表妹均为ALD携带者；先证者姐姐为ABCD，正常基因型。结论在中国人ALD患者中发现了1个新的ABCD1基因突变（fsR89），ABCD1基因突变分析是诊断X—ALD最可靠的方法。