邻苯二甲酸单(2-乙基)己酯对MCF-7细胞DNA的氧化损伤

目的:研究邻苯二甲酸单(2-乙基)己酯(mono-2-ethylexyl phthalate,MEHP)对人乳腺癌MCF-7细胞DNA氧化损伤的作用。方法:分别用不同浓度的MEHP(6.25、12.5、25、50和100μmol/L)和二甲基亚砜(溶剂对照,<0.1%)处理MCF-7细胞12和24 h后用MTT比色法检测细胞的存活率。再分别于染毒后1.5、3、6、12和24 h,测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和细胞8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine,8-OHdG)水平。结果:与对照组比较,MEHP染毒12 h,6.25和12.5μmol/L组细胞的存活率显著增加(P<0.05)。MEHP染毒24 h,在较高浓度处理组(≥25μmol/L)的细胞存活率显著降低(P<0.05);各处理组细胞的SOD活性有所增加,细胞MDA水平、GSH-Px活性以及8-OHdG生成量无显著变化(P>0.05)。当MEHP染毒MCF-7细胞较短时间(1.5、3和6 h)时,各处理组MDA水平和8-OHdG生成量均显著升高(P<0.05),而SOD和GSH-Px活性则显著性降低(P<0.05)。结论:一定浓度MEHP作用在短时间内(1.5、3和6 h)可引起MCF-7细胞的氧化应激反应,并触发细胞DNA的氧化性损伤,具体调控机制有待深入研究。

p63和p73的表达与苯并(a)芘致H1299和16HBE细胞DNA损伤的关系

背景与目的:研究p63与p73的mRNA表达与BaP致人肺腺癌细胞(H1299)和人支气管上皮细胞(16HBE)DNA损伤的关系。材料与方法:分别用不同浓度BaP(8、16、32、64和128μmol/L)处理H1299和16HBE两种细胞,在4 h和12 h时,使用相应的生化检测试剂盒分别测定细胞裂解液中MDA的水平和SOD、GSH-Px的活性,用qRT-PCR方法测定处理后细胞的p53、p63、p73、mdm2和mdm4的mRNA水平;用Comet实验评价细胞DNA损伤程度。结果:16、32和64μmol/L BaP处理4 h时,两种细胞MDA水平显著性升高,SOD和GSH-Px活性显著性下降(P<0.05)。用BaP处理H1299和16HBE细胞4 h和12 h时均观察到DNA损伤随浓度增加而加重,且呈剂量-效应关系(P<0.01),mdm2、mdm4mRNA表达水平升高(P<0.01)。不过仅在12 h时p53基因mRNA表达水平较对照组显著增加(P<0.01)。在4 h和12 h时点,仅在H1299细胞的p63和p73mRNA表达增加(P<0.05)。结论:在BaP致p53缺失的H1299细胞的DNA损伤中,BaP可能通过不依赖p53信号通路激活了p63和p73 mRNA的表达。

碳纳米管对小鼠肝和肺细胞DNA损伤的彗星实验研究

目的检测碳纳米管进入小鼠体内后对小鼠肝细胞和肺细胞DNA的损伤作用。方法将小鼠分别用不同剂量多壁碳纳米管(0.1、0.2、0.4mg/ml)暴露14天,每次0.2ml,每隔24h暴露1次,用单细胞凝胶电泳技术检测肝细胞和肺细胞DNA的损伤程度。结果0.1mg/ml剂量大小的碳纳米管可造成小鼠肝细胞和肺细胞DNA的严重断裂(P<0.01),而0.2、0.4mg/ml剂量则引起了明显的交联作用。结论碳纳米管可造成机体内肝细胞和肺细胞DNA的断裂和交联。

不同浓度的多壁碳纳米管对HEK293细胞的影响

目的研究多壁碳纳米管(MWCNT)对正常人胚肾293细胞的增生及细胞活性的影响。方法采用离体培养的正常人胚肾293细胞株,接种入96孔板,细胞生长18h后加入不同浓度的单壁碳纳米溶液,碳纳米溶液作用于人胚肾293细胞48个h后,使用MTT(methyl thiazolyl tetrazoliun)比色法测每个孔的吸光值,计算人胚肾293细胞的生长抑制率并绘制细胞活性曲线。结果不同浓度的多壁碳纳米管对人胚肾293细胞具有不同程度的抑制作用,且当其浓度达到0.5μg/ml时对细胞出现显著的抑制作用。结论多壁碳纳米管能通过正常人胚肾293细胞膜进入细胞内,一定程度地影响细胞的活性,到达一定剂量时,细胞增生能力显著降低。因此,可以推测多壁碳纳米管对正常细胞生长作用有一定的安全剂量范围。

微格教学及训练中常见教学技能性问题分析

微格教学训练在师范生技能培养中发挥着重要的作用。本文介绍了微格教学相关内容,对微格教学训练中常见教学技能性问题作出了分析并对其解决方案提出了建议。

p73在苯并(a)芘致人肺纤维细胞株MRC-5和人肺腺癌细胞株H1299(p53-null)周期阻滞中的作用

目的研究p73在苯并(a)芘[B(a)P]致人肺纤维细胞株MRC-5和人肺腺癌细胞株H1299(p53-null)周期阻滞中的作用。方法采用0(溶剂对照)、8、16、32、64和128μmol/L的B(a)P分别处理处于对数生长期的MRC-5和H1299细胞24h。采用MTT比色法检测两种细胞系的生长率,采用流式细胞术检测细胞周期各时相的细胞百分比,采用实时荧光定量PCR方法测定p53、p73、p21和Gadd45的mRNA表达水平。结果与溶剂对照组比较,8、16、32、64μmol/LB(a)P染毒组MRC-5细胞和H1299细胞的增殖活性均升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。16μmol/LB(a)P染毒组MRC-5细胞和32μmol/LB(a)P染毒组H1299细胞的增殖活性达到峰值,与溶剂对照组相比,分别增加了40%和30%。与溶剂对照组比较,8、16、32、64和128μmol/L的B(a)P染毒组MRC-5细胞的p53、p73和p21基因mRNA表达水平上升,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),细胞阻滞在G1期。与溶剂对照组比较,8μmol/L的B(a)P染毒组H1299细胞p73和p21基因mRNA表达的表达水平上升,差异均有统计学意义(P<0.05),细胞阻滞在G1期;但各处理组Gadd45基因的mRNA表达水平间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论一定浓度B(a)P可通过p53介导引起MRC-5细胞周期G1期阻滞,而对于p53缺失的H1299细胞,其细胞周期G1期阻滞可能依赖于p73参与的细胞信号通路的调节。

苯并(a)芘对H1299细胞CYP1A1酶活力和相关基因表达的影响

目的研究BaP对人肺腺癌细胞(H1299)CYP1A1酶活力和CYP1A1及其相关基因表达的影响。方法用不同浓度BaP(8、16、32、64和128μmol/L)处理H1299细胞24 h。实时荧光定量PCR方法检测H1299细胞中CYP1A1、HSP90、AhR和ARNT基因的mRNA表达水平;表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)检测CYP1A1和HSP90蛋白表达水平;荧光分光光度法测定CYP1A1酶活力(7-ethoxyresorufin-o-deethylase,EROD)。结果与溶剂对照组相比,CYP1A1和ARNT基因mRNA水平在BaP为16和64μmol/L时有统计学意义(P<0.01),AhR和HSP90在各染毒组中均有统计学意义(P<0.05)。在16、32和64μmol/L的BaP染毒组中,CYP1A1和HSP90蛋白水平高于对照组。在16、32、64和128μmol/L的BaP染毒组中均可诱导CYP1A1酶活力显著性增强(P<0.01)。结论该试验条件下,在H1299细胞,BaP可通过诱导CYP1A1与其上游转录因子AhR和ARNT的mRNA以及蛋白表达而增强CYP1A1酶活力。

B(a)P和DEHP联合染毒对HepG2细胞CYP1A1和CYP3A4酶活性的影响

[目的]研究邻苯二甲酸二乙基己基酯[di(-2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]和苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,B(a)P]联合染毒人肝癌细胞株(HepG2细胞)对其细胞色素P450酶系1A1(cytochrome 1A1,CYP1A1)和细胞色素P450酶系3A4(CYP3A4)酶活性的影响。[方法]分别用B(a)P 64.0μmol/L和DEHP 62.5、125.0、250.0、500.0、1000.0μmol/L单独染毒和两者联合染毒HepG2细胞48h和72h。溶剂对照组为二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO<1‰)。用CCK8法检测细胞活性;用7-乙氧基异吩噁唑-O-去乙氧基酶和7-乙氧基香豆素O-去乙基酶(EROD和ECOD)实验评价细胞CYP1A1和CYP3A4酶活性;分别用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测CYP1A1和CYP3A4基因的mRNA和蛋白质表达水平。[结果]与DEHP单独染毒组相比,联合染毒组细胞的存活率明显下降(P<0.01);EROD和ECOD活性却明显增加(P<0.05,P<0.01);联合染毒组CYP1A1基因仅有mRNA表达增加,但CYP3A4基因在mRNA和蛋白质表达水平均较DEHP单独染毒组明显升高(P<0.01)。[结论]DEHP和B(a)P联合染毒诱导了HepG2细胞CYP1A1和CYP3A4酶活性,并在mRNA和蛋白质水平对CYP1A1和CYP3A4的表达量产生一定影响。

表面等离子体共振技术快速筛检人血清蛋白质表达的方法应用

[目的]建立用表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)技术快速筛检大样本人群血清蛋白质表达的方法,并用该法检测塑料垃圾拆解回收工人血清蛋白质是否存在异常表达。[方法]选取国内某地区从事塑料垃圾拆解回收的208名职业工人为暴露人群,生活水平和生活习惯相近且无已知污染源的197名农业人口为对照人群。用SPR技术检测研究对象血清中HSP90、HSP70、HSP60、CYP1A1和XPA蛋白质含量。[结果]人血清HSP90、HSP70、HSP60、CYP1A1和XPA蛋白质均可检出;用磷酸盐蛋白缓冲液(phosphate buffer solution,PBST)以1:100体积比稀释血清后即可进行检测,检测流速为25μL/min。暴露人群的血清中HSP60、HSP70、CYP1A1蛋白质含量均高于对照人群(P<0.05)。[结论]SPR技术可用于检测大样本人群血清蛋白质的表达,且具有用样量少、高通量、快速、灵敏的优势;从事塑料垃圾拆解回收的工人血清HSP60、HSP70、CYP1A1蛋白质表达量较高,可能与其职业环境中污染物暴露有关。

DEHP与BaP联合诱导Changliver细胞线粒体介导细胞凋亡作用

目的研究邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)与苯并(a)芘(BaP)联合染毒对Chang liver细胞的毒性。方法 DEHP(62.5、125、250、500和1 000μmol/L)与BaP(64μmol/L)单独或联合染毒Chang liver细胞24 h,检测细胞活力、细胞内活性氧(ROS)含量、线粒体膜电位(MMP)、细胞凋亡率和Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)以及半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表达量。结果联合染毒各组细胞存活率均低于DEHP单独染毒组(t=6.22、4.64、6.64、5.84、7.29,P<0.01),但胞内ROS水平均升高(t=4.57、2.23、2.39、2.22、2.16,P<0.05或P<0.01);≥250μmol/L DEHP与BaP联合染毒组的MMP分别为(80.12±6.41)%、(69.92±5.56)%和(53.76±1.88)%,均低于BaP单独染毒组的(165.93±5.09)%(t=10.92、12.51、14.62,P<0.01);细胞凋亡率分别为(7.73±1.91)%、(11.00±3.04)%和(14.20±3.96)%,均高于BaP单独染毒组的(1.55±0.21)%(t=3.96、6.06、8.11,P<0.01);此外,活化caspase-3的高表达和升高的Bax/Bcl-2比值也被检出。结论较高浓度DEHP与BaP联合染毒Chang liver细胞促发ROS水平升高和线粒体膜电位降低,并导致了细胞凋亡;Bax、Bcl-2和活化caspase-3参与了此调控过程。

p73和GADD45α蛋白在邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯致人正常肝细胞L02和人肝癌细胞Hep3B周期阻滞中的作用

目的研究抑癌基因p73和生长抑制及DNA损伤诱导基因45α(GADD45α)蛋白对邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯[di(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP]染毒人正常肝细胞L02和人肝癌细胞Hep3B周期的影响。方法将处于对数生长期的L02细胞和Hep3B细胞分别暴露于终浓度为0(溶剂对照,DMSO终浓度<1‰)、6.25、12.502、5.00、50.00、100.00μmol/L的MEHP溶液染毒细胞12 h。采用四甲基氮唑蓝(methylthiazoletetrazolium,MTT)比色法检测细胞增值率,采用流式细胞仪检测细胞的周期时相,采用Western blot法检测细胞周期调控蛋白p53、p73和GADD45α的表达量。结果与溶剂对照组相比,仅50μmol/L MEHP染毒L02细胞的增殖率升高(P<0.05),各浓度MEHP染毒Hep3B细胞的增殖率均下降(P<0.01),差异有统计学意义。与溶剂对照组相比,仅100μmol/L MEHP染毒L02细胞的G1期和G2期细胞构成比下降,S期细胞构成比上升,差异均有统计学意义(P<0.05);而100μmol/L MEHP染毒Hep3B细胞的G1期和25.00、50.00、100.00μmol/L MEHP染毒Hep3B细胞的S期细胞构成比下降,50.00和100.00μmol/L MEHP染毒Hep3B细胞的G2期细胞构成比上升,差异均有统计学意义(P<0.01)。与溶剂对照组相比,各浓度MEHP染毒L02细胞均未见p53p、73和GADD45α蛋白表达量明显增加,差异无统计学意义;而各浓度MEHP染毒Hep3B细胞p73蛋白表达量和50.00、100.00μmol/L MEHP染毒Hep3B细胞GADD45α蛋白表达量均升高,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论一定浓度MEHP(50μmol/L和100μmol/L)可能通过独立于p53途径诱导p73和GADD45α蛋白表达增加而导致p53基因缺失的Hep3B细胞阻滞在G2期。