血小板生成素诱导胎肝CD34^+造血干/祖细胞增殖分化与周期蛋白表达的关系

为了解胚胎时期巨核细胞增殖分化特有的内在机制 ,本研究观察了在体外培养体系中 ,胎肝源CD3 4 +造血干 /祖细胞在血小板生成素 (thrombopoietin ,TPO)作用下增殖分化特征与相关周期蛋白B1、D1和D3表达及细胞内水平变化的关系。结果发现 :( 1)经 12d培养后 ,TPO使胎肝源CD3 4 +细胞数从 1× 0 5个细胞 /ml增加到 13 12± 4 0 6× 10 5个细胞 /ml,CD4 1+细胞增加到了 95 % ,CD3 4 +细胞下降到了 3 % ,大部分细胞的DNA倍性为 2N ,少数为 4N ,无大于 4N巨核细胞 ,TPO对MegaCultTm C胶原半固体培养体系中胎肝源CD3 4 +细胞形成CFU Mk集落产率的影响呈明显的剂量效应关系 ;( 2 )在整个培养期间 ,周期蛋白B1表达逐渐增加 ,并保持在一个高水平上 ,培养后期 ,高水平的周期蛋白B1出现在G1期细胞上 ;( 3 )周期蛋白D1和D3表达先增加 ,培养后期细胞内水平下降 ,且以G2期细胞为主。该结果提示 :( 1)TPO通过上调周期蛋白B1和在所有细胞周期时限上调周期蛋白D1和D3表达 ,促进巨核细胞祖细胞的增殖分化 ;( 2 )周期蛋白B1在G2 +M期的持续高水平和周期蛋白D1和D3在G2 +M期的水平下降 ,可能导致胎肝源巨核细胞核内有丝分裂延迟或阻滞。

自体CIK治疗技术细胞制品制备面临的问题与持续改进的思考

细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)过继免疫细胞治疗技术已经成为肿瘤治疗的重要手段之一。在我国该技术已经进行临床应用,部分省份已经将其纳入医疗保险。然而,该技术在一些方面存在着很多问题,亟待改进。本文主要讨论了在cGMP生产设施设计、建设和管理,CIK制备质量控制和无菌试验等三方面存在的问题,并提出改进意见。

基因重组白细胞介素3刺激胎肝巨核细胞祖细胞生长的特性

本文采用血浆凝块、甲基纤维素半固体和液体培养体系结合流式细胞仪巨核细胞DNA双荧光分析，观察了4～5个月胎肝和成人骨髓CFU－MK在体外的增殖和分化特点。结果表明，无论以基因重组白细胞介素3（Interleukin－3，rIL3）或再障狗血清（Meg－CSA）作为刺激因子，股肝CFU－MK集落均较大（大于50个细胞／集落），而成人骨髓CFU－MK集落均较小（小于50个细胞／集落）。在以rIL3（2ng／ml）为刺激因子时，胎肝巨核细胞祖细胞（CFU－MK）集落产率（36.40±16．60）高于成人骨髓（10．05±2．81）（P＜0．01）。与此相反，胎肝CFU－MK源巨核细胞DNA倍性分布以2N和4N为主，成人骨髓则以8N和4N为主，前者的平均倍性值（5．46±0．86）明显低于后者（10．13±1．30）（P＜0．01）。同样，在以Meg－CSA为刺激因子时，也获得了类似的结果，提示胎肝CFU－MK具有很强的增殖能力和较低的分化（倍体化）能力。另外，胎肝CFU－MK集落产率在rIL3浓度为0．5～2ng／ml时逐渐上升，而在2～8ng／ml则持续下降。但在相同浓度范围内，rIL3对成人骨髓CFU－MK和胎肝CFU－GM的作用均无这种双向效应。Meg－CSA（5％～25％）对股肝、成人骨髓CFU－MK和胎肝CFU－GM的作用也呈明显的剂量效应曲线。而且，胎肝CFU－MK源巨核细胞DNA倍性?

CD226在TPO诱导胎肝Lin-细胞增殖分化过程中的表达

目的研究CD226在造血干/祖细胞上的表达分布。TPO诱导胎肝造血干/祖细胞增殖分化过程中，CD226表达的变化及可能的信号调控途径。方法采用鸡尾酒单抗阴性分离富集Lin－造血干/祖细胞，培养于含TPO的无血清培养体系中，用PD98059阻断MAPK信号转导途径，流式细胞仪双荧光分析CD226、CD34、CD41a和CD61的表达。结果CD226在Lin－CD34＋细胞和Lin－CD34－细胞上均有表达。TPO可诱导Lin－CD41a－CD226－细胞先分化为CD41a＋CD226－细胞，再进一步分化为CD41a＋CD226＋细胞，TPO也可诱导Lin－CD226＋细胞表达CD41a和CD61。在培养的早期，PD98059可抑制CD34＋CD226＋细胞的减少，在晚期则可抑制CD41a＋CD226＋细胞的增多。结论CD226与造血干/祖细胞和巨核细胞的增殖分化可能具有密切的关系。

选择式目标管理在医院学科发展中的应用

选择式目标管理是目标管理的模式之一,其核心是逐级选择和分解目标并实施有序监控和适当指导。针对军队医院中以科研为主的学科进行选择式目标管理时,介绍其对目标设定,采取的行动及取得的成效。

流式细胞仪分析人正常骨髓巨核细胞DNA含量和倍体性分布

本文采用流式细胞仪,对经血小板特异性单抗和碘化丙啶双标染色的人正常骨髓巨核细胞 DNA 倍体性进行了分析。经 Percoll(≤1.050g/ml)分离后,骨髓中血小板 GPIX 阳性巨核细胞明显升高,而在去除巨核细胞骨髓中(>1.050g/ml)血小板 GPIX 阳性巨核细胞的含量极少。未分离骨髓中和经 Percoll 分离骨髓中血小板 GPIX 阳性巨核细胞 DNA 倍体分布无明显差异,其 DNA主次峰依次为16N(36%)和32N(24%),2N 和4N 巨核细胞占23%左右。值得注意的是在经 Percoll分离骨髓中2N 和4N 血小板 GPIX 阳性巨核细胞却低于血小板 GPⅡb/Ⅲa和血小板 GPⅢa阳性巨核细胞。

不同浓度亚砷酸对NB_4细胞凋亡的影响

目的 研究不同浓度的亚砷酸对NB4 细胞凋亡的影响。方法 采用流式细胞术、DNA电泳和免疫印迹研究测定亚砷酸对NB4 细胞凋亡作用。结果 (1)经 0 8～ 8μmol·L-1亚砷酸作用 16h后 ,NB4 细胞生存力为 95 0 %以上 ,有“梯状”DNA电泳带和亚二倍体峰 ,细胞在G2 期阻滞 ,但bcl 2表达明显下调 ;(2 )浓度在 10～ 80 μmol·L-1时 ,虽然凋亡广泛发生 ,bcl 2表达明显下调 ,但细胞生存率也降至 31 2 % ;(3)浓度在 40 0 μmol·L-1时 ,细胞生存力为 (80 3± 8 9) % ,无“梯状”电泳带、细胞周期阻滞和bcl 2下调 ,76 6 %细胞被dUTP FITC标记 ,但荧光强度低 ,这也说明在高浓度时 ,亚砷酸诱导凋亡的作用受到了抑制。结论 提示亚砷酸不仅可以诱导NB4 细胞凋亡也可以抑制其凋亡。在低浓度时 ,亚砷酸诱导凋亡的作用强于其抑制凋亡。高浓度时相反。因此 ,通过有机化或化学结构的改变降低其抑制作用可能有助于提高疗效。

血小板生成素诱导胎肝CD34^+造血干/祖细胞增殖分化过程中周期蛋白表达的变化

为了解胚胎时期巨核细胞增殖分化特有的内在机制,本研究观察了在体外液体培养体系中,胎肝源CD34^+造血千/祖细胞在血小板生成素(TPO)作用下增殖分化特征与相关周期蛋白B1、D1和D3表达及细胞内水平变化的关系。结果表明:①经12天培养后,TPO使胎肝源CD34细胞数从1×10~5个/ml增加到13.12±4.06×~5个/ml,CD41^+细胞增加了95%,CD34^+细胞下降了3%,大部分细胞的DNA倍性为2N,少数为4N,无>4N巨核细胞:②在整个培养期间,周期蛋白B1表达逐渐增加,并保持在一个高水平上,培养后期,高水平的周期蛋白B1出现在GI期细胞上:③周期蛋白D1和D3表达先增加,培养后期细胞内水平下降,且以G2期细胞为主。本研究结果提示:①FPO通过上调周期蛋白B1和在所有细胞周期时限上调周期蛋白D1和D3表达,促进巨核细胞祖细胞的增殖分化;②周期蛋白B1在G2+M期的持续高水平和周期蛋白D1和D3在G2+M期的水平下降可能导致了胎肝源巨核细胞核内有丝分裂延迟或阻滞。

亚砷酸钠通过上调周期蛋白B_1表达选择性诱导G_2+M期NB_4细胞凋亡

为探讨亚砷酸钠诱导NB_4细胞凋亡的作用机制,采用流式细胞术、DNA电泳和免疫印迹研究亚砷酸钠对NB_4细胞的作用。结果表明:①亚砷酸钠作用的NB_4细胞先阻滞在G_2+M期,而后发生凋亡;④dUTP-FITC特异性标记G_2+M期NB_4细胞,而且发生在G_2+M期阻滞后;③亚砷酸钠处理NB_4细胞的周期蛋白A、E、D_1、D_2和D_3无明显变化,周期蛋白B_1表达随作用时间的延长而增加;④流式细胞仪分析显示在亚砷酸钠处理的早期,有部分S期细胞表达周期蛋白B_1,晚期大部分高表达周期蛋白B_1细胞是处于G_2+M期,有少量亚倍体细胞高表达周期蛋白B_1。上述结果提示,亚砷酸钠通过上调周期蛋白B_1选择性地诱导G_2+M期NB_4细胞的凋亡。

免疫酶标染色观察胎儿巨核细胞造血

本文采用血小板 GPⅡb/Ⅲa单抗并结合 ABC 技术,3～6个月胎儿肝脏和3～7个月胎儿骨髓的巨核细胞造血进行了观察.结果发现在胎肝中,巨核细胞主要位于生长旺盛的胎肝细胞间和造血岛附近,一些巨核细胞是淋巴细胞样的巨核细胞.巨核细胞在胎肝中和胎儿骨髓中形态均较小,平均直径分别为14.79±4.52μm和16.08±7.39μm.胎儿肝脏和骨髓中的巨核细胞大小不随胎龄增加而变化.但胎肝中巨核细胞的成熟程度却随胎龄增加而增加,而且胎儿骨髓中巨核细胞的成熟程度低于正常成人骨髓中的巨核细胞。

细胞凋亡与白血病

细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡(programmed cell death)不仅存在于正常组织与器官,调节着机体细胞生长与更新间的平衡稳定,也存在于各种肿瘤组织中,与肿瘤的发生有密切的联系,它与白血病的关系也越来越引起人们的重视。本文就此问题进行综述。 1 基本概念细胞凋亡与坏死不同,是机体清除生存组织中单个细胞的一种死亡形式。

发育中人胎儿骨髓和肝脏巨核细胞DNA含量和倍体性的变化

用流式细胞仪结合血小板GP/Ⅱb/Ⅲa单抗直接免疫荧光和碘化丙啶(PI)DNA染色双标技术,对30例妊娠3～6个月胎儿肝脏和39例妊娠3～8个月胎儿骨髓中巨核细胞DNA含量及倍性进行了分析。结果显示尽管随妊娠月份的增加,胎儿肝脏和骨髓中巨核细胞DNA倍体分布逐渐由低倍体向高倍体演变,但两者仍明显低于成人。这表明胎儿巨核细胞的核内复制次数(或能力)低于成人,胚胎时期巨核细胞的这种低倍体分布可能与新生儿血小板质量和数量的异常有关。

流式细胞仪双荧光分析巨核细胞白血病巨核细胞DNA倍性

采用流式细胞仪对4例巨核细胞白血病的抗原分布和巨核细胞DNA的倍性进行了分析,发现血小板特异抗原分布在各个病例间有一定波动,提示白血病巨核细胞系恶性克隆可以发生在造血干细胞向巨核细胞分化的不同阶段。病态巨核细胞DNA倍性分布大部分处于2N,少部分处于4N,无高于4N的巨核细胞,提示其DNA倍体化过程受阻。超微结构显示白血病细胞有凋亡现象的出现,提示白血病巨核细胞堆积可能与其凋亡的减少有关。

巨核细胞造血调控

巨核细胞是血小板的前体细胞.巨核细胞造血是血小板释放进入血循环前的细胞发育过程,包括有丝分裂、核内有丝分裂和细胞浆成熟等,其调控机制非常复杂.近年来,由于血小板生成素(thrombopoietin,TPO)的分离纯化和重组表达及对基质细胞在巨核细胞造血方面作用研究的深入,使巨核细胞造血调控的研究有了突破性进展.

低剂量雄黄诱导NB_4细胞凋亡的研究

目的:探讨复方黄黛片中主要成分雄黄治疗急性早幼粒细胞白血病的作用机理。方法:应用台盘蓝排染法、流式细胞仪、DNA电泳、免疫印迹等多项方法,体外研究雄黄对NB4细胞的促凋亡作用。结果:雄黄对NB4细胞的生长有抑制作用,并有促凋亡效应,对细胞周期的影响表现为G2M期的阻滞,药物处理的早期细胞凋亡,未见伴有bc1-2的下调。结论:雄黄作用的早期主要以细胞凋亡为主,并且可能通过其他途径诱导细胞凋亡。

化疗联合DC-CIK治疗老年晚期非小细胞肺癌的疗效评价

目的探讨化疗联合树突细胞诱导的细胞因子激活的杀伤细胞(DC-CIK)治疗晚期非小细胞肺癌的疗效。方法收集2010年1月—2012年1月收治的非小细胞肺癌62例设为DC-CIK组,应用化疗联合DC-CIK治疗。选择发病时间、年龄相近,性别、病理及分期(大多为临床分期)相同的肺癌62例设为对照组,应用相同化疗。比较两组2年内中位生存时间及总生存率。结果 DC-CIK组和对照组中位生存期分别为16、13个月。DC-CIK组生存率明显高于对照组(P<0.05)。结论老年非小细胞肺癌患者应用化疗联合DC-CIK治疗,能显著提高2年内的中位生存时间和总生存率。

非小细胞肺癌患者放疗前后机体免疫功能变化的研究

目的:报道30例非小细胞肺癌(NSCLC)患者放疗前后免疫功能的变化。方法:采用双抗体夹心法和比浊法检测血清中sIL2R、免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)含量;用单克隆抗体和流式细胞仪技术检测外周血中T细胞亚群、B细胞、NK细胞百分数;与健康人做对照。结果:放疗前sIL2R显著增高(P<0.01),IgG及IgM亦增高(P<0.05),B细胞百分数低下(P<0.01),CD3+细胞降低(P<0.01),CD4+/CD8+比值降低(P<0.05);放疗后sIL2R含量显著下降(P<0.01),IgG亦降低(P<0.05),B细胞百分数下降(P<0.05),CD3+细胞进一步下降(P<0.05),CD4+/CD8+比值亦降低(P<0.05);IgM和NK细胞放疗前后无变化。临床Ⅳ期者比Ⅱ、Ⅲ期者CD4+/CD8+比值更低(P<0.01)。结论:放射治疗会使宿主机体免疫功能降低。

CIK在无血清培养体系中的增殖、表型变化和抗肿瘤活性

目的:探索细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)在无血清体系中的增殖规律、表型变化及其抗瘤活性。方法:不同培养基培养CIK细胞,采用活细胞计数法观察CIK细胞的增殖,流式细胞仪检测CIK细胞的表型,CytoTox96非放射性细胞毒试剂盒检测CIK细胞的细胞毒活性。结果:经过细胞因子和抗体刺激后,CIK细胞能明显增殖,无血清培养基加自体血浆组最高可扩增473.28±27.53倍,无血清培养基组可扩增218.24±16.86倍,而RPMI1640加FCS只扩增11.52±1.04倍。CD3++CD8+、CD3++CD56+、CD226++CD11a+和CD305++CD11a+细胞随着培养时间的延长而增加,而CD3++CD4+细胞则明显减少。CIK细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用明显高于LAK细胞(P<0.01),且其细胞毒活性随着培养时间的延长而增高。结论:CIK细胞在体外扩增能力强,对肿瘤细胞的杀伤活性高,有望成为新一代抗肿瘤过继免疫细胞制剂而应用于临床。

自体CIK细胞联合化疗一线维持治疗非小细胞肺癌的疗效与安全性

目的探讨自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)在晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者维持治疗中的应用前景及意义。方法选取2011年3月—2013年9月收治的确诊的ⅢB或Ⅳ期NSCLC患者80例,随机分为联合组与对照组,每组40例。对照组均采用单药多西他赛或培美曲塞方案一线维持治疗,联合组先行单药培美曲塞或多西他赛一线维持化疗,间隔半个月后再行自体CIK细胞免疫治疗。对两组进行生存分析、评价近期疗效、检测外周血T淋巴细胞表型、卡氏功能状态量表(KPS)评分及生活质量测评、监测毒性反应。结果两组间无进展生存期无差异(P>0.05);联合组客观缓解率及疾病控制率均高于对照组(P<0.05);联合组治疗后T淋巴细胞亚群水平与本组治疗前及对照组治疗后比较均有统计学差异(P<0.05);联合组KPS评分提高率显著优于对照组(P<0.05);治疗后联合组疲倦、气促、失眠、食欲下降、恶心呕吐等症状改善,躯体功能及总生活质量评分均显著优于对照组及本组治疗前(P<0.05);联合组中性粒细胞降低发生率、胃肠道反应发生率均明显低于对照组(P<0.05)。结论自体CIK细胞联合化疗与单纯化疗相比,可显著提高接受一线维持治疗的晚期NSCLC患者的免疫功能、改善生活质量、降低毒性反应、提高化疗耐受性、获得更高的总体有效率。

自体CIK细胞治疗对不同阶段肿瘤患者免疫功能的影响

目的探讨自体细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)治疗对不同阶段的恶性肿瘤患者免疫功能的影响。方法 162例恶性肿瘤患者分为A组(肿瘤晚期临终患者,预计生存期<3个月)、B组(存在远处转移或局部晚期肿瘤患者,预计生存期>3个月)和C组(根治术后患者),另选取健康志愿者作为空白对照组(D组)。检测治疗前后A、B、C 3组患者及D组免疫功能的变化,包括CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+和CD4+/CD8+T淋巴细胞亚群水平,并监测治疗相关的不良反应。结果自体CIK细胞治疗前,A、B、C组患者CD3+、CD3+CD4+T细胞亚群水平低于D组,CD3+CD8+T淋巴细胞亚群水平高于D组,差异均有统计学意义(P<0.05)。经过2次自体CIK细胞治疗后,A组患者CD3+T细胞水平较治疗前降低(P<0.05),CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+和CD4+/CD8+与D组比较差异有统计学意义(P<0.05);B组治疗后CD3+、CD3+CD56+T淋巴细胞水平较治疗前升高(P<0.05),CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+与D组比较差异有统计学意义(P<0.05);C组治疗后CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD56+T细胞亚群水平较治疗前升高(P<0.05),CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+和CD4/CD8与D组比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组患者因回输CIK引起的不良反应发生率较低,组间差异均无统计学意义。结论自体CIK细胞治疗可增强细胞免疫功能,纠正恶性实体瘤患者外周血T细胞亚群紊乱状态,治疗相关的不良反应可耐受,经对症处理后均可缓解,且不良反应与肿瘤所处阶段无关。