逆转录病毒介导的反义c-myb对肝星状细胞增殖及Ⅰ型胶原基因表达的影响

目的 :探讨反义c -mybRNA对体外培养的肝星状细胞 (HSC)增殖及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响。方法 :构建含有反向c-myb基因片段的重组逆转录病毒载体pDOR -myb ,将其导入包装细胞PA317中 ,收获含病毒的培养上清 ,进一步感染体外培养的大鼠HSC ,采用四甲基偶氮唑盐 (MTT)法测定细胞增殖反应 ,采用半定量RT -PCR检测c -myb、α1-Ⅰ型胶原mRNA表达。结果 :成功分离培养大鼠HSC ,感染pDOR -myb病毒的HSC自身c -myb表达、细胞增殖及α -Ⅰ型胶原mRNA表达显著受抑。结论 :c-myb在HSC激活增殖过程中起重要作用 ,反义c-myb基因能抑制HSC增殖及Ⅰ型胶原基因表达 ,这提示抑制c -myb表达可能是防治肝纤维化的有效途径。

c-myb反义RNA重组载体构建及其包装细胞株的建立

【目的】构建反义c myb重组逆转录病毒载体并建立其包装细胞株。【方法】采用RT PCR方法 ,获取目的基因 ,通过TA克隆方法克隆入 pUC19,再反向亚克隆入逆转录病毒载体 pDOR中。采用DOTAP法将重组逆转录病毒载体转入包装细胞 ,以NIH3T3细胞为靶细胞测定产病毒滴度。【结果】序列测定结果与GenBank中序列一致。c myb基因片段已定向克隆入 pDOR。细胞转染表明 ,已形成稳定的包装细胞株PA317/pDOR myb ,产病毒滴度达 5 2× 10 4 ～ 9 5× 10 4 CFU/mL。【结论】成功构建了含有反义c myb的重组逆转录病毒质粒 。

HGV广东株和香港株NS5区部分基因的克隆及序列分析

采用ＨＧＶＮＳ５特异的２对引物，对两个香港株和一个广东株ＨＧＶＲＮＡ进行逆转录套式ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ产物克隆入ｐＵＣ１９，重组质粒转化ＤＨ５α和ＪＭ１０９菌株。ＰＣＲ和酶切法鉴定阳性克隆，双脱氧链末端终止法测定核苷酸序列并进行同源性分析。结果发现核苷酸变异呈散在分布，三株间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为９３．３％～９４％及９７％～９９．２％，与已报道的中国株（ＣＮ）相比，则同源性分别为９０％～９１．２％和９４％～９６．３％，与美国株（ＰＮＦ２１６１及Ｒ１０２９１）相比，为８７．１％～８９．５％和９５．２％～９７％，而与西非株（ＧＢＶＣ）相比，则达９１．４％～９３．８％和９７％～９７．９％。提示ＨＧＶＮＳ５区核苷酸和氨基酸序列相对保守，不同ＨＧＶ株存在一定的地区差异。

CTLA4Ig基因重组腺病毒载体的构建及其体外表达

【目的】构建表达人CTLA4Ig的非复制型重组腺病毒载体并检测其在真核细胞中的表达。【方法】分离人外周血单个核细胞，提取细胞总RIgA，经RT-PCR分别扩增含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外段及IgG恒定区（含绞链区-CH2-CH3）基因片段。将PCR产物克隆入pCDNA3，阳性重组子以双酶切和测序鉴定。将目的基因CTLA4-Ig亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV，与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183，经细菌内同源重组构建重组腺病毒载体。采用脂质体法转染293细胞包装产生重组腺病毒，进一步感染HepG2细胞，采用RT-PCR及ELISA测定CTLA4Ig表达情况。【结果】构建了表达人CTLA4Ig基因的重组腺病毒，病毒滴度可达6×10^9pfu／mL，并能在HepG2和骨髓间充质干细胞中表达CTLA4Ig。【结论】成功构建表达CTLA4Ig的重组腺病毒载体，为进一步研究肝细胞移植排异及自身免疫性疾病的免疫调节治疗提供有力的手段与工具。

肝纤维化基因治疗的研究进展

肝纤维化仍缺少有效的治疗措施。本文将围绕近年来对肝纤维化形成机制的认识 ,对采用基因治疗防治肝纤维化的相关探索性研究作一综述。

HGV NS5A区部分基因的克隆及表达

目的 构建含HGVNS5A区基因的原核表达载体。方法 采用PCR方法从重组了HGV 6 6 72 - 72 92区段基因的pUC19中扩增出HGV 6 86 4- 72 77nt片段 ,定向克隆入pGEMEX1质粒 ,再经SacⅠ、HindⅢ酶切亚克隆入高效表达载体pRSETA。结果 重组pRSETA 经序列测定证实插入基因为目的基因 ,符合表达框架 ,经IPTG诱导 ,在BL2 1(DE3)菌株中表达连接 6个组氨酸的HGVNS5A融合蛋白。Westernblotting显示在Marker约 2 5kDa处可见明显的蛋白带 ,与预期结果一致。结论 成功构建了重组HGVNS5A区基因表达载体 ,在BL2 1(DE3)中能有效表达。

清热活血补益方影响肝脏胶原代谢的分子生物学机制

目的 :从分子生物学水平研究中药复方清热活血补益方 (肝纤方 )如何影响大鼠肝脏的胶原合成及降解。方法 :运用血清药理学方法制备中药含药血清 ,将之作用于从SD大鼠肝脏分离培养的肝星状细胞 ,并测定Ⅰ型胶原含量、Ⅰ型前胶原mRNA的表达和胶原酶活性。结果 :与对照组相比 ,含药血清组Ⅰ型胶原含量降低 ,Ⅰ型前胶原mRNA的表达受到抑制 ,胶原酶的活性增加 (P <0 .0 5 )。结论 :清热活血补益方通过抑制Ⅰ型前胶原mRNA的表达来减少胶原的合成 ,通过提高胶原酶的活性来促进胶原的降解 ,这可能是其多位点抗肝纤维化的部分分子生物学机制。

慢性乙肝患者停用拉米夫定后出现肝功能衰竭的危险因素

【目的】研究慢性乙型病毒性肝炎(chronichepatitisB,慢性乙型肝炎)患者停用拉米夫定后出现肝功能衰竭的危险因素。【方法】停用拉米夫定治疗后复发的慢性乙型肝炎患者71例纳入研究,记录治疗前病程、诊断、拉米夫定疗程,用拉米夫定前、停用时和复发后的生化指标、免疫学指标、病毒学指标及YMDD变异、前C区变异,按复发后的诊断分为肝功能衰竭组和慢性乙型肝炎组进行比较。【结果】肝功能衰竭组患者中位年龄38.0岁,大于慢性乙型肝炎组31.5岁(Z=3.49,P<0.01);年龄(Wald=10.13,P<0.05)和拉米夫定治疗前诊断为失代偿性肝硬化(Wald=7.61,P<0.05)都是停药反跳后出现肝功能衰竭的独立危险因素。肝功能衰竭组服拉米夫定前总胆红素异常患者20.0%(字2=16.50,P<0.01),停拉米夫定后未随访者86.7%(字2=17.57,P<0.01),停拉米夫定时未出现Anti鄄HBe阳转者85.2%(字2=8.04,P<0.01),复发时HBVDNA载量3.0×108±4.8×108(Z=4.46,P<0.01),前C区联合YMDD变异者56.0%(字2=11.69,P<0.01),均高于慢性乙型肝炎组。【结论】拉米夫定治疗前年龄大、总胆红素异常、诊断为失代偿性肝硬化,停药时未发生Anti鄄HBe阳转,停药后无随访,复发时HBVDNA载量超过1×108拷贝/mL、出现前C区联合YMDD变异可能是停拉米夫定后出现肝功能衰竭的危险因素。

SD大鼠肝脏星状细胞分离培养及方法的改进

目的:建立高效、简便的肝星状细胞分离方法。方法:采用改良原位灌流、12%Optiprep密度梯度离心法分离大鼠肝星状细胞,desmin和α-SMA免疫细胞化学检测鉴定星状细胞性质。结果:肝星状细胞的得率稳定在3×107/肝以上,纯度为95%左右,存活率为98%,传代培养10代以上,细胞增殖及转分化状态仍良好。结论:肝星状细胞分离培养成功,对分离方法的改进措施可行。

肝癌患者乙型肝炎病毒X基因变异的研究

目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因变异在肝癌发生中的作用.方法:应用聚合酶链反应(PCR)技术从5例肝细胞癌患者及12例慢性乙型肝炎患者血清中扩增X基因,然后将纯化的PCR产物进行序列测定,对获得的序列进行变异性及同源性分析.结果:肝细胞癌患者中得到的HBV X基因序列与Genebank中多个已发表的HBV各血清亚型序列进行同源性比较,发现核苷酸同源性在89—96％之间,血清亚型以adw为主.与非肝癌组的比较发现X基因序列的替换突变中存在4种形式.6个位点的变异仅出现于肝癌组,12个热点变异多见于肝癌组而少见于非肝癌组.结论:X基因序列的突变与肝细胞癌的发生有关。

基因芯片技术检测HBV HCV及HBV YMDD变异株

目的:探讨基因芯片技术在乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)及HBVYMDD变异株检测中的应用.方法:采用HBV、HCV联合基因芯片检测40份血清标本,并与HBV,HCV基因定量检测方法比较;采用HBVYMDD变异株芯片检测20份血清标本,并与错配PCR及DNA序列测定方法比较.结果:HBV,HCV联合基因芯片与HBVDNA定量检测的符合率为85%(34/40),HBV检出率为83%(19/23),假阳性率为12%(2/17);与HCVRNA定量检测的符合率为85%(34/40),HCV检出率为58%(7/12),假阳性率为4%(1/28).HBVYMDD变异株芯片与本室设计的错配PCR符合率为70%(14/20),5份芯片检测的标本与DNA序列测定结果一致,该芯片尚可检测出不同病毒体或变异体的混合感染.结论:HBV,HCV联合基因芯片对HBV的检测有较高的敏感性,但存在一定程度的非特异性;对HCV的检测敏感性偏低,但特异性较高.HBVYMDD变异株芯片敏感性和特异性均较高,同时能检测出病毒变异体的共生现象.

临检样本中甲型和戊型肝炎病毒IgM抗体检测的比较

目的比较分析临检样本中甲型和戊型肝炎病毒IgM抗体(抗HAV-IgM和抗HEV-IgM)检测状况。方法收集非流行年份成人临床检验样本32600份。采用酶免疫法(EIA)捕捉抗体法检测抗-HAVIgM,EIA间接法检测抗-HEVIgM。结果32600份中送检抗-HAVIgM者为1785份,阳性34例,阳性率为1.9%,送检抗-HEVIgM者1820份,阳性88例,阳性率为4.84%。比较分析显示,抗-HEVIgM阳性率相对较高(χ2=23.668,P<0.01),且具有季节上相对分散,年龄上以30岁以上为主,性别上男女相差相对较小等特点。结论非流行年份成人临床检验样本中,抗HAV-IgM和抗HEV-IgM检出率相对较低,但相对甲型肝炎来说,戊型肝炎更值得广泛注意。

重组人BMP-7真核表达质粒的构建及转染软骨细胞后的表达

[目的]构建重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7)基因真核表达质粒,转染兔关节软骨细胞,探讨外源性人rhBMP-7基因在转染软骨细胞中的表达情况及对细胞生物学性状的影响。[方法]采用PCR技术扩增rhBMP-7基因,将其插入真核表达载体pcDNA 3.1中,体外分离培养兔关节软骨细胞,然后用构建的rhBMP-7质粒转染软骨细胞,经G418筛选、免疫组化染色和逆转录PCR检测其表达,同时检测表达产物对维持软骨细胞表型的作用。[结果]经过PCR及酶切鉴定证实获得了BMP-7真核表达质粒pcDNA 3.1-rhBMP-7,通过免疫组化染色和逆转录PCR鉴定证实rhBMP-7在转染后的软骨细胞中得到了表达,其表达产物促进软骨细胞表型的维持。[结论]外源性rhBMP-7基因转染软骨细胞可以获得高效表达,并具有一定的维持软骨细胞表型的作用,为软骨组织工程的研究提供了改良的种子细胞。

细菌内同源重组法构建HBV S区和C区基因非复制型腺病毒载体及其体外表达

目的:构建表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的非复制型重组腺病毒载体,并检测他能否在真核细胞中有效表达目的基因。方法:扩增乙肝病毒(HBV)前S_2/S基因和前C/C基因片段,分别亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生分别携带HBV S区和C区基因的重组腺病毒载体pAd-HBs和pAd-HBe,经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad-HBs和Ad-HBe体,外转染293和Vero细胞,RT-PCR和ELISA法检测目的基因的表达。结果:构建了表达HBsAg和HBeAg基因的重组腺病毒,病毒滴度可达5×10^(12)pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因。结论:成功构建表达HBsAg和HBeAg的重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础。

广东省HIV-1流行株的基因亚型分析

目的 了解广东省人免疫缺陷病毒 - 1(HIV - 1)感染毒株的亚型分布情况。方法 用巢式聚合酶链反应 (nPCR)技术 ,对 1998年初至 2 0 0 2年 2月间广东省内 13例HIV - 1感染者血标本进行膜蛋白基因 (env)部分片段扩增 ,将扩增产物克隆至T载体上并进行序列分析。结果 在 11例扩增成功的血标本中 ,B亚型 6例 ,其中 3例来自献血人员 ,1例为性乱人员和 2例为吸毒人员 ;E亚型 5例 ,其中 3例为性乱人员 ,1例来自吸毒人员 ,1例来自献血人员。 5例E亚型基因离散率为 ( 6 6± 3 8) % ;6例B亚型基因基因离散率为 ( 7 6± 1 9) % ,与来自泰国和国内的B亚型代表株最接近。结论 广东省至少有HIV - 1B和E亚型毒株流行 ,且分布广泛 。

抗HBc-ScFv基因复制缺陷型腺病毒载体的构建及其体外表达

目的:构建表达抗乙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体(抗HBc ScFv)的复制缺陷型腺病毒载体,并检测其能否在真核细胞中有效表达目的基因. 方法:采用DNA重组技术将特异性人源性抗卜HBc单链抗体基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与5 型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染B15183细菌,经细菌内同源重组产生携带抗HBc ScFv基因的重组腺病毒载体pAd—ScFV,经脂质体法转染293细胞,包装产生携带抗HBc scFv基因的重组腺病毒Ad—scFv,体外转染HepG2细胞,PCR和ELISA法检测目的基因及其表达. 结果:构建了表达抗HBc ScFv基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1015 PFU/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因. 结论:成功构建表达抗HBc ScFv的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步开展抗HBc ScFv在抗HBV基因治疗中的作用研究提供实验基础.

骨形态发生蛋白7在慢性HBV感染者肝组织中的表达

【目的】通过对不同慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者肝组织中骨形态发生蛋白7(BMP-7)表达的分析,初步探讨BMP-7在肝脏炎症和肝细胞再生过程中可能发挥的作用。【方法】对56例慢性HBV感染者及5例正常对照肝组织进行常规组织学观察,按病理诊断分组。其中病毒性肝炎乙型慢性轻度12例,中度12例,重度6例,重型8例,乙肝肝硬化10例,肝癌8例。进行BMP-7的免疫组织化学染色,观察光镜下分布特点,取部分标本进行图像分析。取8例肝癌患者癌结节及3例癌旁组织进行实时荧光定量RT-PCR,检测BMP-7mRNA的表达。【结果】BMP-7阳性单位在正常人肝脏(7.27±2.88)、病毒性肝炎(乙型)慢性轻度(8.50±3.22)、中度(10.96±2.88)、重度(13.11±1.26)有逐渐增加趋势,重型肝炎(7.50±1.21)、肝硬化(8.24±1.79)较中度、重度低;进一步比较BMP-7阳性区灰度有相似结果(P值均小于0.01)。BMP-7在肝脏既有胞浆型表达,也有胞膜型表达。在慢性中度、重度患者及肝硬化结节内为弥漫性表达;但在重型肝炎患者,仅呈灶状表达;在癌周组织有弥漫或灶状表达,在癌结节表达极少。【结论】在慢性乙型肝炎患者肝组织中BMP-7表达增多,但是在重型肝炎肝组织及肝癌结节中表达减少,值得进一步研究。

趋化因子RANTES水平与慢性乙型肝炎患者肝脏炎症程度的关系

[目的]了解慢性乙型肝炎患者肝脏组织趋化因子RANTES水平与肝脏炎症程度是否相关。[方法]64例慢性乙型肝炎患者和10例正常人肝组织按照炎症分级标准分为G0-G4,并用免疫组织化学染色定性及图象分析系统定量检测肝组织趋化因子RANTES表达。[结果]慢性乙型肝炎组的肝组织RANTES的表达量较正常对照组显著为高(P<0.05); G0—G4肝组织RANTES的表达量分别为3.7±1.5,15.0±5.7,21.6±5.9,30.3±8.2和40.9±12.3阳性单位值,随着慢性乙型肝炎患者肝脏组织炎症分级的增加,肝组织RANTES的表达强度逐渐升高且各级之间比较均具有显著的差异(P<0.05)。[结论]趋化因子RANTES在慢性乙型肝炎的发病机制中具有重要的作用。

CC类趋化因子配体5水平与慢性乙型病毒性肝炎患者肝脏炎症程度的关系──附64例检测分析

目的：探讨慢性乙型病毒性肝炎（慢乙肝）患者肝组织CC类趋化因子配体5（CCehemokine ligand5，CCL5）水平与肝脏炎症程度的关系。方法：64例慢乙肝患者和10名正常人的肝组织标本按照炎症（G）分级标准分为G0-G4，用免疫组织化学染色定性厦图像分析系统定量检测肝组织趋化因子CCL5的表达情况，并用Spearman等级相关分析进行相关性分析。结果：10名正常人的肝组织炎症分级均为G0，慢乙肝组则分别为G115例、G220例、G217例、G412例。慢乙肝组肝组织CCL5的表达明显高于正常对照组（P=0.000）；G0-G4者肝组织CCL5的表达阳性单位（positive unit，PU）分剐为（3．7±1．5），（15．0±5．7），（21．6±5．9），（30．3±8．2）和（40．9±12．3），慢乙肝患者的肝组织CCL5的表达程度与肝组织炎症分级之间呈显著的正相关（r=0．865，P=0．000）。结论：CCL5在慢乙肝肝脏炎症的发生中具有重要作用。

长期培养的大鼠原代肝细胞功能和形态学观察

目的研究大鼠原代肝细胞长期体外培养后功能和形态的变化。方法采用两步胶原酶原位灌流法分离大鼠肝细胞,并用Percoll分离液进行密度梯度离心进一步纯化肝细胞,采用0.4%台盼蓝染色观察细胞活力。然后将细胞接种于HepatoZYME-SFM培养基中培养,定期收集肝细胞培养液上清检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白、尿素氮的水平。采用乙氧基试卤灵O-脱乙基酶活性(EROD)方法检测肝细胞P450的CYPⅠA1功能。结果新鲜分离的大鼠肝细胞总数(2-3)×108cells/wholeliver,Percoll分离液纯化后活力和纯度在90%以上。HepatoZYME-SFM培养下肝细胞生长良好并保持正常形态。AST、ALT水平在培养3d后下降显著,6-9d后趋于相对稳定的低水平。白蛋白的分泌功能、尿素合成能力在18d内维持在较高水平。可在3-6d检测到CYPⅠA1酶活性。结论Percoll液纯化新分离肝细胞可提高其活率和纯度,HepatoZYME-SFM培养条件下肝细胞可有效保持良好形态结构和一定的生物合成代谢能力,适合肝细胞的体外长期培养和功能研究。