CCR10通过NRF2抑制结直肠癌细胞铁死亡的机制研究

目的探究C-C趋化因子受体10(C-C chemokine receptor 10,CCR10)在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)中对细胞增殖和铁死亡的影响,并探究其影响铁死亡的机制。方法在GEPIA数据库(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)共表达分析CCR10与铁死亡关键基因的相关性。构建慢病毒介导的CCR10过表达(CCR10-OE)、敲除(CCR10-KO)及其阴性对照(NC)稳转HCT116细胞,采用细胞活力(CCK8)、克隆形成和裸鼠成瘤实验检测CCR10过表达或敲除后的细胞增殖。利用CCK8法、流式细胞术检测细胞铁死亡和脂质过氧化,评估CCR10过表达及敲除后细胞对铁死亡诱导剂erastin和rsl3的耐受。利用WB检测CCR10过表达和敲除后铁死亡关键蛋白质的表达。在CCR10敲除细胞株瞬时转染核因子E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,NRF2)质粒,鉴定铁死亡表型以及其下游分子溶质载体家族7成员11(solute Carrier Family 7 Member 11,SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione Peroxidase 4,GPX4)、铁重链蛋白1(ferritin Heavy Chain 1,FTH1)表达水平。结果CCR10表达与铁死亡抑制基因BCL-2(r=0.54,P<0.001)、FTH1(r=0.18,P<0.001)和NRF2(r=0.31,P<0.001)呈正相关,与铁死亡驱动基因TP53(r=-0.46,P<0.001)、TFRC(r=-0.45,P<0.001)和KEAP1(r=-0.29,P<0.001)呈负相关。CCR10过表达促进CRC细胞增殖(P<0.01),而CCR10缺失抑制CRC细胞增殖(P<0.01)和小鼠皮下肿瘤生长(P<0.001)。CCR10过表达或缺失分别抑制或促进其对铁死亡的敏感性(P<0.01),并影响转录因子NRF2表达。结论CCR10基因可以通过上调转录因子NRF2表达而抑制erastin和rsl3诱导的CRC细胞铁死亡。

不同时相移植人骨髓间充质干细胞对人脐血CD34^+细胞植入NOD/SCID小鼠的影响

为了观察不同时相移植人骨髓间充质干细胞(MSC)对脐血(UCB)CD34+细胞移植的NOD/SCID小鼠造血重建的影响,明确最佳的移植时机,将体外培养扩增的人骨髓MSC分别于c细胞移植同时、移植前48小时及移植后48小时输入经60Coγ射线照射的NOD/SCID小鼠,观察共移植后42天内小鼠外周血白细胞和血小板变化,并于移植后42天处死小鼠,用FACS检测外周血、骨髓和脾脏人源细胞含量。结果表明:(1)MSC和UCB CD34+细胞同时输注可明显降低外周血白细胞和血小板下降幅度,缩短白细胞和血小板恢复时间;二者不同时输注均不降低白细胞和血小板下降幅度,且输注UCB CD34+细胞后48小时输注MSC时外周血血小板恢复时间明显晚于同时输注者。(2)与单纯UCB CD34+细胞移植相比较,不同时相输注MSC均可促进UCB CD34+细胞的植入,三个共输注组间促进骨髓各系造血植入效应无明显差异。结论:人骨髓MSC与UCB CD34+细胞共移植时,以同时移植效果最佳,此结果为MSC的临床应用提供了实验依据。

人骨髓间充质干细胞体外支持脐血CD34^+细胞增殖的研究

为了研究人骨髓间充质干细胞(MSC)作为滋养层细胞体外支持脐血CD34+细胞扩增的作用,将MSC和胎儿骨髓来源的成纤维细胞样骨髓基质细胞系(HFCL)经60Coγ线照射后分别制备细胞滋养层,比较不同滋养层细胞和添加或不加细胞因子对脐血CD34+细胞增殖数及LTC-IC数的影响。结果表明,无论有无添加细胞因子(rhFL、rhSCF、rhTPO),HFCL滋养层组培养12天扩增细胞数明显高于MSC滋养层组,以第0天细胞数为100%(下同),有细胞因子组为(9797±361)%vs(7061±418)%,无细胞因子组为(5305±354)%vs(1992±247)%,均P<0.01。MSC滋养层组CD34+细胞扩增数与HFCL滋养层组相比无显著差异[(825±305)%vs(820±191)%,P>0.05],但在细胞因子存在时低于HFCL滋养层组[(939±212)%vs(1617±222)%,P<0.01]。MSC滋养层组维持脐血中LTC-IC的能力明显优于HFCL滋养层组[第5周CFU-GM数(129.95±8.73)个/105接种细胞数vs(89.81±10.29)个/105接种细胞数,P<0.05];细胞因子存在时,其作用更为明显[第5周CFU-GM数(192.93±4.95)个/105接种细胞数vs(90.47±14.28)个/105接种细胞数,P<0.01]。MSC与HFCL按一定比例混合,可提高扩增效率。当MSC与HFCL之比为4∶1时,集落形成数量最高,达(186.89±11.11)个/105接种细胞数,明显高于比例为3∶2(131.45±13.02)个/105接种细胞数和二者单用组[前者(138.92±14.84)个/105接种细胞数,后者(64.63±6.11)个/105接种细胞数;均P<0.01]。结论:MSC维持脐血中LTC-IC集落形成的能力优于基质细胞系HFCL,HFCL支持脐血CD34+细胞的增殖能力优于MSC,MSC加上适量HFCL可显著提高CD34+细胞扩增效率。

阳离子脂质体介导hFL真核表达载体在骨髓基质细胞系中的表达

目的 :阳离子脂质体介导hFL真核表达载体pIRESlneo/hFL转染人骨髓基质细胞系HFCL细胞 ,观察hFL在HFCL细胞中的表达。方法 :以阳离子脂质体介导法将重组真核表达载体 pIRESlneo/hFL导入人骨髓基质细胞系HFCL细胞 ,G418筛选获得的阳性细胞以Southernblot和Northernblot分别检测其基因组DNA整合和mRNA转录 ,Westernblot检测其蛋白表达 ,ELISA及人脐血CD34+细胞增殖实验检测其蛋白表达量和活性。结果 :hFL基因己整合到靶细胞HFCL基因组DNA中 ,在mRNA和蛋白质水平上均可检测到其表达 ,ELISA法测得hFL的表达量为 (6 0 .3± 0 .3)ng .10 6Cell-1·d-1,分泌量在细胞传代 30次后仍保持稳定 ,并且表达的hFL具有良好的生物学活性。结论 :阳离子脂质体介导的hFL真核表达载体在人骨髓基质细胞系HFCL中获得持续稳定表达 ,并具有良好的生物学活性。

逆病毒介导EGFP基因转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

目的探讨逆转录病毒介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染人骨髓间充质干细胞(hBM-MSC)的可行性。方法携带EGFP的重组逆转录病毒载体(EGFP-RV)转染体外培养扩增的hBM-MSC,嘌呤霉素筛选,获得表达EGFP的hBM-MSC/EGFP,以未转染的hBM-MSC为对照组,观察两组细胞的形态、生长特性、表面分子表达及向脂肪细胞、成骨细胞分化的潜能。结果EGFP-RV转染hBM-MSC后,获得稳定表达EGFP的hBM-MSC/EGFP;hBM-MSC/EGFP的细胞形态、生长特性、表面分子表达及向脂肪细胞、成骨细胞分化的潜能与未转染的hBM-MSC无差别。结论逆转录病毒介导的EGFP可作为人骨髓间充质干细胞的良好示踪剂。

上皮间质细胞转化的分子机制及其在肿瘤转移中的作用

上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是具有极性的上皮细胞转换成为具有移行能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程,它存在于人体多个生理和病理过程中。EMT与肿瘤细胞的侵袭和转移有着密切的关系。E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)用于维持正常细胞间连接的稳定性,其表达水平与EMT的发生以及肿瘤的侵袭能力呈负相关,是EMT的关键分子。转录因子如锌指蛋白Snaill、SIP1等可下调E-cad的表达而促进EMT;Slug、Twist也可诱导EMT的发生。多种生长因子如HGF、TGF-β等可通过细胞内多个不同信号转导途径调控EMT的发生,促进肿瘤的转移。细胞外基质(ECM)对EMT的发生起着重要的作用,整合素介导的细胞与基质之间的黏附作用改变可引起EMT,基质金属蛋白酶(MMPs)通过影响ECM诱导EMT的发生。不同的MicroRNA如microRNA-10b或microRNA-200对EMT发生有促进或抑制作用。发生EMT的肿瘤细胞可获得某些类似于干细胞的能力如自我更新等,而胚胎干细胞在分化时伴有类似EMT过程的分子生物学事件。EMT的分子生物学过程、信号转导通路还有待更深入地研究完善。

人FL基因高效真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 :构建人FL真核表达载体 pIRES1neo/hFL ,观察其在COS 7细胞中的表达。方法 :采用RT PCR方法自人白血病细胞系TF 1中克隆可溶型FL(Flt3 ligand)cDNA片段 ,测序鉴定正确后 ,插入真核表达载体 pIRES1neo中的EcoRI和BamHI位点 ,构建hFL真核表达载体 pIRES1neo/hFL。脂质体介导法将其转染COS 7细胞 ,72h以RT PCR检测转染细胞中外源hFL基因的转录、ELISA法及脐血CD34 + 细胞增殖实验测定转染细胞上清中hFL的含量和活性。结果 :酶切鉴定表明成功构建了重组真核表达载体 pIRES1neo/hFL ;外源hFL基因能在转染细胞中有效转录 ;ELISA法测得 72h后培养上清中的hFL含量为每 2 4小时 2 5 1ng/ 10 6cells,并且分泌的hFL具有良好的生物学活性。结论 :构建hFL真核表达载体在COS 7细胞中具有良好的表达活性。

低剂量辐射对小鼠外周血干/祖细胞的动员作用

目的：探讨低剂量辐射对小鼠外周血干／祖细胞的动员效应。方法：采用深部X线对小鼠进行低剂量辐射，甲基纤维素半固体培养、流式细胞仪检测单纯低剂量辐射及联合粒细胞集落刺激因子（G-CSF）后外周血粒单系造血祖细胞集落（CFU-GM）及造血干祖细胞数量（c-kit^＋细胞数）。结果：小鼠受到25-75mGy照射后外周血CFU-GM集落数明显增多，c-kit^＋细胞数平行增加，其中以75mGy组最明显；受照后24hCFU-GM集落数开始增加，72h最明显，96h后有所下降。75mGy＋半量G-CSF组周围血CFU-GM集落数及c-kit值均明显高于单纯低剂量照射组，接近全量G-CSF组。结论：低剂量辐射对小鼠外周血干／祖细胞有动员效应，联合应用G-CSF有明显的协同作用。

转FL、GM-CSF基因的人骨髓基质细胞促进脐血CD34^+细胞体外扩增

研究转FL、GM CSF基因的基质细胞对脐血CD34+ 细胞的扩增效应。将转FL、GM CSF基因的人骨髓基质细胞系与脐血CD34+ 细胞共培养 ,观察细胞总数、CD34+ 细胞数、CFU GM的变化情况。培养到第 4周时 ,第 (4 )组 (SCF+IL 3+IL 6 +GM CSF +FL)和第 (8)组 (HFCL/hGM CSF +HFCL/hFL +SCF +IL 3+IL 6 )的细胞总数增加到最大 ,分别扩增了 717± 2 4 4 7和 70 9± 6 3 6 3,第 1周 ,第 (5 )组 (HFCL +SCF +IL 3+IL 6 )扩增了 10 5± 2 0 8倍 ,较第 (8)组减少 (P <0 0 5 )。第 1周时 ,CD34+ 细胞总数第 (4 )组和第 (8)组分别扩增了 8 4 4倍和 11 5倍 (P <0 0 5 ) ,CD34+ 细胞百分率第 (7)组 (FCL/hFL +SCF +IL 3+IL 6 )为 5 0 2 % ,第 (6 )组 (HFCL/hGM CSF +SCF +IL 3+IL 6 )为 2 8 95 % (P <0 0 1)。第 2周 ,各组CFU GM增加显著 ,以第 (4 )组和第 (8)组增加最为明显 ,以后随扩增时间延长 ,造血细胞集落数、集落体积逐渐减少。表明转FL、GM CSF基因的基质细胞 ,能有效的协同其他细胞因子对脐血CD34+ 细胞产生明显的扩增作用 。

小分子干扰RNA沉默RhoGDI2基因表达对结肠癌细胞增殖侵袭的影响及其机制

目的:应用小分子干扰RNA(siRNA)沉默RhoGDI2基因的表达,初步探讨其对结肠癌细胞增殖、迁移能力的影响及可能的机制。方法:分别运用Western blot和RT-q PCR检测结肠癌细胞株RKO、HT29、SW620、SW480、HCT116基因RhoGDI2的表达情况。设计并合成RhoGDI2 siRNA干扰序列,按照LipofectamineTM2000转染方法将siRNA干扰序列转染到目的细胞,设置实验干扰组、空白对照和阴性对照组;CCK-8实验检测细胞增殖能力,细胞划痕试验和Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力。结果:人结肠癌细胞株RhoGDI2表达量由高到低依次是RKO、HT29、SW620、SW480、HCT116;RKO细胞siRNA干扰后RhoGDI2表达抑制率大于70%:实验干扰组、阴性对照组、空白对照组细胞增殖率分别是(0.683±0.013)、(0.866±0.088)、(0.905±0.008),P<0.05;实验干扰组细胞迁移、侵袭速率较对照组均减慢。沉默RhoGDI2基因的表达,实验组细胞E-Cadherin较对照组表达量高,Vimentin蛋白表达下降。结论:结肠癌RhoGDI2基因沉默可能通过抑制EMT进程阻止肿瘤恶性生物学行为。

RhoGDI2与EMT相关蛋白在结直肠癌组织中表达的临床意义及相关性

目的探讨RhoGDI2与EMT相关蛋白(E-cadherin、Vimentin)在结直肠癌组织中表达的临床意义以及它们之间的相关性。方法收集行手术切除且随访满5年的结直肠癌患者组织标本80例。应用免疫组化法检测标本中RhoGDI2与EMT相关蛋白的表达情况,分析它们与各临床病理参数间的关系,探讨RhoGDI2与EMT相关蛋白间的相关性。结果RhoGDI2、E-cadherin、Vimentin在结直肠癌组织中的阳性表达率分别为27.5%、23.6%、48.7%。结直肠癌组织中,RhoGDI2的表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期及5年生存率相关(P<0.05);E-cadherin的表达与肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及5年生存率相关(P<0.05);Vimentin的表达与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期及5年生存率相关(P<0.05)。结直肠癌组织中,RhoGDI2与Vimentin的表达呈正相关(r=0.295,P<0.05);RhoGDI2、Vimentin与E-cadherin的表达呈负相关(r=-0.278、r=-0.309,P<0.05)。结论 RhoGDI2与EMT相关蛋白在结直肠癌组织中的表达密切相关,我们推测RhoGDI2可能通过促进EMT的发生导致了结直肠癌的侵袭、转移及不良预后。

结直肠癌中RhoGDI2的表达与肿瘤侵袭、转移及预后的关系

目的:探讨RhoG DI2在结直肠癌中的表达与肿瘤侵袭、转移及预后的关系。方法:应用Northern blot和Western blot检测具有不同侵袭、转移潜能的人结直肠癌细胞系(SW620、SW480)中RhoG DI2 mRNA及蛋白的表达。收集行手术切除并随访满5年的结直肠癌患者原发灶癌组织石蜡标本80例及相应的癌旁非癌组织、转移性淋巴结癌组织石蜡标本各20例。应用免疫组化法检测上述120例标本中RhoG DI2蛋白的表达,分析其与临床病理特征及预后的关系。结果:SW620、SW480人结直肠癌细胞系中RhoG DI2 mRNA及蛋白的表达具有统计学差异(P<0.01),前者表达均高于后者。结直肠癌相关组织中RhoG DI2蛋白存在差异性表达(转移淋巴结癌组织>原发灶癌组织>癌旁非癌组织,P<0.01)。RhoG DI2蛋白在结直肠癌组织中的表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、远处转移、周围淋巴管浸润、周围神经浸润、TNM分期显著相关(P<0.05)。RhoG DI2高表达的结直肠癌患者5年生存率显著低于低表达者(P<0.01)。高RhoG DI2表达是结直肠癌的独立预后因素之一(P<0.05)。结论:RhoG DI2在结直肠癌中的高表达与肿瘤的侵袭、转移及预后不良密切相关,可能是一个有效的结直肠癌预后标志物。

BsAb HER-2×CD3对过度表达HER-2乳腺癌细胞的细胞毒作用

目的 :研究应用抗HER 2抗原和CD3抗原的双向基因工程抗体BsAbHER 2×CD3介导T淋巴细胞对过度表达HER 2乳腺癌细胞的细胞毒作用。方法 :以过度表达HER 2的乳腺癌细胞株SK BR 3为靶细胞 ,T淋巴细胞为效应细胞 ,采用MTT法、3 H TdR掺入法测定BsAbHER 2×CD3对靶细胞、效应细胞的抑制作用及其介导的效应细胞对靶细胞的杀伤作用。结果 :BsAbHER 2×CD3具有MAbHER 2和MAbCD3的双重特性 ,既能抑制SK BR 3细胞生长 ,又可促进正常人外周血T淋巴细胞增殖。BsAbHER 2×CD3介导T淋巴细胞对靶细胞产生显著的细胞毒作用 ,明显强于MAbHER 2对靶细胞的作用 ,E∶T =2 0∶1为最佳效靶比。结论 :BsAbHER 2×CD3 ,既可以与HER 2过度表达的肿瘤细胞特异性结合 ,又可以介导T淋巴细胞对肿瘤细胞产生特异性杀伤作用 。

15例纯红细胞再生障碍性贫血临床分析

目的 :探讨纯红细胞再生障碍性贫血的病因、发病机制、诊断和治疗。方法 :采用回顾性病例分析方法。结果 :纯红细胞再生障碍性贫血有多种病因 ;骨髓象有诊断意义 ;激素、免疫抑制剂、大剂量球蛋白、EPO、环孢菌素 A治疗均有效。结论

肃肺化痰、理气活血法为主治疗肺心病急发期的临床体会

慢性肺源性心脏病(下称肺心病)是东北地区常见多发病之一,我们根据中医“肺主气”、“心主血”、“肺与大肠相表里”等理论,拟肃肺化痰、理气活血法治疗肺心病急发期31例,对其中重症结合西医对症治疗(下称治疗组),并与单纯西药治疗组(下称对照组)进行对照观察,获得满意疗效。

共济失调毛细血管扩张征突变基因多态性(rs189307)与肺癌易感性关系的Meta分析

目的综合评价共济失调毛细血管扩张征突变(ataxia-telangiectasia mutated,ATM)基因多态性(rs189307)与肺癌易感性的关系。方法应用计算机检索PubMed、EMBase、Cochrane Library、万方、中国知网和维普等数据库,按照纳入和排除标准选择文献,评价文献质量并提取资料,采用Stata 12.0软件进行Meta分析,计算ATM rs189307与肺癌易感性关系的合并比值比(odds ratio,OR),并进行亚组分析、发表偏倚检验和敏感性分析。结果最终纳入5项病例对照研究,共包括3036例患者和3415例正常对照。Meta分析结果显示,ATM rs189307AA基因型显著增加了亚洲人群肺癌的发病风险(GG vs AA,OR=0.83,95%可信区间(confidence interval,CI)=0.72-0.96,P=0.011;GG+GA vs AA,OR=0.86,95%CI=0.76-0.97,P=0.017)。在吸烟状况的亚组分析中,ATM rs189307AA基因型显著增加了非吸烟人群肺癌的发病风险(GG vs AA,OR=0.69,95%CI=0.56-0.86,P=0.001;GG+GA vs AA,OR=0.68,95%CI=0.56-0.82,P=0.000)。结论 ATM rs189307AA基因型是亚洲人群肺癌易感性增加的危险因素,尤其是对于非吸烟人群。

增强型绿色荧光蛋白转染活细胞效率的研究

目的研究影响增强型绿色荧光蛋白(EGFP)逆转录病毒表达系统转染活细胞效率的主要相关参数,建立一种稳定高效的活细胞EGFP标记技术。方法培养、扩增携带EGFP逆转录病毒载体的包装细胞PG13,分别于12 h、24 h、36 h和48 h收集病毒液,转染骨髓基质细胞(BMSCs),通过流式细胞仪和荧光显微镜检测不同时间点病毒转染效率。选择转染率最高时间点的病毒液,连续转染BMSCs两次,小剂量嘌呤霉素筛选6 h,观察病毒转染率及细胞活力。再以上述方法转染脂肪基质细胞(ADSCs)和成纤维细胞(FBs),观察这种方法标记其他干细胞或成熟分化细胞的可行性。结果根据流式细胞仪及荧光显微镜观察结果,24 h收集的病毒液转染BMSCs效率最高(64.56+2.53)%,36 h次之(56.98+3.22)%,12 h(47.39±1.82)%与48 h(37.84±1.77)%相对较低。连续转染两次并经短暂筛选后,BMS(s转染率可达80%以上,且细胞活力不受影响。采用相同方法转染脂肪基质细胞(ADSCs)和成纤维细胞(FBs),转染率均能达到80%,且细胞形态、增殖能力均未见明显改变。结论本实验建立了一种稳定高效的活细胞EGFP转染技术,为研究组织工程种子细胞的体内、外转归及细胞间相互作用提供了稳定且直观的检测手段。

活血化瘀通络法治疗类风湿性关节炎30例

病例选择标准:根据1988年第一届全国中西医结合风湿类疾病学术会议修订的“类风湿性关节炎”诊断标准选择临床研究对象。中医辨证标准参考该会议制订的“中医分型”诊断标准执行。临床资料:对符合类风湿性关节炎诊断标准的住院患者采用随机方法分为治疗组及对照组。