Taq DNA耐热聚合酶在大肠杆菌中的克隆和高表达

从水生栖热菌(Thermus aquaticus)YT-1中分离得到的Taq DNA 聚合酶是一种广泛应用于PCR的耐热DNA聚合酶。由于天然菌株酶产量较低,培养条件要求严格,酶的纯化过程极为繁琐而使产品成本较高,因而促使人们构建适合于大规模生产的基因工程菌株。已有人分别通过不同的途径,使用不同的载体,成功地在大肠杆菌菌株中表达了Taq 耐热DNA聚合酶基因。我们通过与前人不同的途径,把这一基因克隆到大肠杆菌的载体质粒pJLA503上并使其得以高表达,为降低生产成本和进一步研究该酶的各种特性提供了有利条件。

奶牛ZFY、ZFX基因片段的克隆及测序

奶牛的早期胚胎性别鉴定是奶牛胚胎分割及移植技术产生较大经济效益的前提，用ＰＣＲ技术进行早期胚胎性别鉴定具有准确、快速、灵敏度高的特点。利用人和鼠的性别分化相关的ＤＮＡ序列ＺＦＹ、ＺＦＸ基因序列设计的引物对公牛和母牛的染色体ＤＮＡ、ＰＣＲ扩增，将扩增产物定向克隆到ｐＵＣ１１８上，获得ＺＦＹ、ＺＦＸ转化子，并测定了ＺＦＹ、ＺＦＸ基因的序列，发现两者同源性达８８．２％，以此为基础可设计引物和探针，以ＰＣＲ方法进行高灵敏度的奶牛性别鉴定。

耐热FD DNA多聚酶在PCR中的应用条件

探索了用于多聚酶链式反应(PCR)的FD DNA多聚酶的最适反应条件在100μl的反应液中含有25 mmol/L的Tris-HCl(pH8.0),25 mmol/L的(NH_4)_2SO_4,1.5 mmol/L的MgCl_2,200 μg/ml的明胶,dNTP各200 μmol/L,模板量为3.3×10～(-2)Pg,引物量各为290 nmol/L,1～2 U的耐热FD DNA多聚酶,30次循环反应的系统为通用PCR最适反应系统。应用这一反应系统,混迹于大量DNA分子中的特定DNA片段可借助于琼脂糖凝胶电泳专一性地、快速而有效地检出。

耐热FD DNA聚合酶高产菌株的诱变选育

以亚硝基胍、紫外线和丝裂霉素处理栖热杆菌FD3009(Thermus Sp.FD3009),从诱交群体中选得抗紫外线、丝裂霉素和氟尿嘧啶的菌株FD 20·1(Ther-mus Sp.FD20·1).FD20·l对高温和pH的适应范围与FD3009一样,但菌落的色泽较浅,呈淡黄色,其耐热DNA聚合酶的比活力比FD 3009提高了37.8%。