苯并(a)芘和邻苯二甲酸二丁酯联合染毒对L02细胞STAT3及p-STAT3水平的影响

目的探讨苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,BaP]和邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)体外染毒对人正常肝细胞(L02)细胞信号传导与转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)的表达及其活化(p-STAT3)的影响。方法将体外培养的L02细胞分为对照组(0.1%DMSO)、BaP低、中、高剂量单独染毒组(12.5、25.0、50.0μmol/L BaP)、DBP低、中、高剂量单独染毒组(25.0、50.0、100.0μmol/L DBP)和BaP、DBP低、中、高剂量联合染毒组(12.5μmol/L BaP+25.0μmol/L DBP、25.0μmol/L BaP+50.0μmol/L DBP、50.0μmol/L BaP+100.0μmol/L DBP)。染毒72 h后,用倒置显微镜观察细胞形态,应用实时荧光定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测各染毒组STAT3 mRNA的表达水平,免疫印迹(Western blot)方法观察STAT3和p-STAT3蛋白的表达水平。结果细胞染毒72 h后,12.5μmol/L BaP、25.0μmol/L DBP和12.5μmol/L BaP+25.0μmol/L DBP低剂量染毒组的细胞形态改变不明显,仅少量细胞的细胞壁模糊;25.0μmol/L BaP、50.0μmol/L DBP和25.0μmol/L BaP+50.0μmol/L DBP中剂量染毒组细胞开始出现模糊,部分细胞由不规则形变为椭圆形,细胞间隙变大;50.0μmol/L BaP、100.0μmol/L DBP和50.0μmol/L BaP+100.0μmol/L DBP高剂量染毒组贴壁细胞数量减少,漂浮细胞增多,胞体缩小变圆,细胞间隙明显变大,细胞核增大;BaP、DBP联合染毒组较其对应的单独染毒组细胞形态学改变明显。与对照组相比,除12.5μmol/L BaP、25.0μmol/L BaP、25.0μmol/L DBP和12.5μmol/L BaP+25.0μmol/L DBP组外,其余各染毒组的STAT3 mRNA表达水平皆明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。BaP、DBP联合染毒组中,中剂量组(25.0μmol/L BaP+50.0μmol/L DBP)的STAT3 mRNA表达水平明显低于BaP中剂量单独染毒组(P<0.05),高剂量组(50.0μmol/L BaP+100.0μmol/L DBP)的STAT3 mRNA表达水平明显低于BaP、DBP高剂量单独染毒组(P<0.05)。与对照组相比,除12.5μmol/L BaP、25.0μmol/L BaP、25.0μmol/L DBP和12.5μmol/L BaP+25.0μmol/L DBP组外,其余各染毒组STAT3、p-STAT3蛋白的表达水平皆明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。BaP、DBP联合染毒组中,除低剂量组(12.5μmol/L BaP+25.0μmol/L DBP)外,中(25.0μmol/L BaP+50.0μmol/L DBP)、高(50.0μmol/L BaP+100.0μmol/L DBP)剂量组的STAT3、p-STAT3蛋白的表达水平皆明显低于各BaP、DBP中、高剂量单独染毒组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论BaP、DBP染毒可下调L02细胞的STAT3转录表达水平,抑制STAT3的活化(p-STAT3)程度,尤以BaP、DBP联合染毒时抑制作用更为明显。此可能是BaP、DBP致肝细胞凋亡损伤的重要环节。

NF-κB p65及相关细胞因子在邻苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘致大鼠肝功能损伤中的作用

目的:探讨核因子-κB(NF-κB)p65及相关细胞因子在邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和苯并(a)芘(BaP)致大鼠肝功能损伤中的作用,为丰富DBP、BaP致大鼠肝脏损伤的机制提供支撑。方法:于2019年9至12月,将160只SPF级SD大鼠按性别、体重采用完全随机分组法分为空白对照组、溶剂对照组(玉米油)、DBP_(50) mg/kg(DBP_(50))组、DBP_(250)mg/kg(DBP_(250))组、BaP_(1) mg/kg(BaP_(1))组、BaP_(5)mg/kg(BaP_(5))组、DBP_(50) mg/kg+BaP_(1) mg/kg(DBP_(50)+BaP_(1))组和DBP_(250)mg/kg+BaP_(5)mg/kg(DBP_(250)+BaP_(5))组,每组20只,雌雄各半,连续灌胃染毒90 d。染毒结束后收集大鼠血清、分离肝脏,采用实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹法分别检测大鼠肝组织NF-κB p65的mRNA及蛋白表达水平;酶联免疫吸附法检测血清中趋化因子-13(CXCL-13)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量;赖氏比色法检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)的水平。结果:除BaP_(1)组外,其余各染毒组大鼠肝组织NF-κB p65的mRNA及蛋白表达水平均明显高于空白对照组(P<0.05),其中DBP与BaP联合染毒组大鼠肝组织NF-κB p65的表达水平均明显高于各DBP、BaP单独染毒的低、高剂量组(P<0.05)。与空白对照组比较,除BaP_(1)组外,其余各染毒组大鼠血清CXCL-13、IL-6水平均增加,且以DBP_(250)+BaP_(5)组增加更明显(P<0.05)。各染毒组TNF-α水平均明显高于空白对照组,其中DBP与BaP联合染毒组大鼠血清TNF-α水平均明显高于各DBP、BaP单独染毒的低、高剂量组(P<0.05)。此外,与空白对照组比较,除BaP_(1)组外,其余各染毒组大鼠血清AST水平均升高(P<0.05),其中DBP与BaP联合染毒组大鼠血清ALT、AST水平皆明显高于各DBP、BaP单独染毒的低、高剂量组(P<0.05);而各染毒组ALB水平明显低于空白对照组(P<0.05);DBP_(250)组、BaP_(5)组和DBP_(250)+BaP_(5)组TP水平明显低于空白对照组,并以DBP_(250)+BaP_(5)组降低更明显(P<0.05)。Pearson相关性分析显示,DBP单独染毒时,NF-κB p65蛋白表达水平与血清IL-6、TNF-α、ALT水平呈正相关关系(r=0.762、0.951、0.924,P<0.05)。BaP单独染毒时,NF-κB p65蛋白表达水平与TNF-α、ALT水平呈正相关关系(r=0.911、0.910,P<0.05)。DBP与BaP联合染毒时,NF-κB p65蛋白表达水平与CXCL-13、IL-6、TNF-α、ALT、AST水平均呈正相关关系(r=0.711、0.764、0.955、0.903、0.827,P<0.05)。另外,DBP、BaP单独染毒时,大鼠血清TNF-α与ALT呈正相关关系(r=0.883、0.894,P<0.05)。DBP与BaP联合染毒时,CXCL-13、IL-6、TNF-α与ALT水平呈正相关关系(r=0.871、0.925、0.942,P<0.05),与AST水平亦呈正相关关系(r=0.910、0.892、0.890,P<0.05)。结论:DBP、BaP单独及共同暴露可上调大鼠肝脏组织内NF-κB p65的表达水平,从而调控下游相关细胞因子的异常分泌,进而导致大鼠肝细胞损伤;DBP、BaP共同暴露时肝脏损伤作用增强。

饮用水有机提取物对正常人肝细胞中活性氧及细胞凋亡因子表达的影响

目的观察饮用水有机提取物染毒对正常人肝细胞(L02)中活性氧(reactive oxygen species,ROS)及细胞凋亡因子表达水平的影响。方法利用固相萃取法提取饮用水中有机污染物。将L02细胞分别暴露于培养液(空白对照)、0.1%DMSO(溶剂对照)和0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000 L/ml饮用水有机提取物中72 h。采用流式细胞术检测ROS水平,分别采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法和Western blot法检测细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)mRNA、蛋白的表达水平,采用酶联免疫吸附试验(Elisa)检测天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)酶的活力。结果与溶剂对照组比较,2.5000、5.0000 L/ml有机提取物染毒组L02细胞内的ROS水平较高,差异均有统计学意义(P<0.05);且随着有机提取物染毒剂量的升高,L02细胞内的ROS水平呈上升趋势。与溶剂对照组比较,1.2500、2.5000、5.0000 L/ml有机提取物染毒组L02细胞内的Cyt C mRNA和蛋白表达水平均较高,差异均有统计学意义(P<0.05);且随着有机提取物染毒剂量的升高,L02细胞内的Cyt C mRNA和蛋白表达水平均呈上升趋势。与溶剂对照组比较,各剂量有机提取物染毒组L02细胞内的Caspase-9及Caspase-3酶活力均较高,差异均有统计学意义(P<0.05);且随着有机提取物染毒剂量的升高,L02细胞内的Caspase-9及Caspase-3酶活力均呈上升趋势。结论饮用水有机提取物可引起L02细胞ROS水平增加,导致Cyt C表达水平上调,进而诱导Caspase-9和Caspase-3酶活力水平升高。氧化损伤调控肝细胞凋亡因子变化可能是饮用水有机提取物致肝细胞损伤的重要环节。