大菱鲆肠道中广谱拮抗活性乳酸菌的筛选及其细菌素鉴定

应用牛津杯法从大菱鲆肠道分离的乳酸菌中筛选出对革兰氏阳性和阴性细菌均具有抑制作用的菌株LP1-4,经生理生化反应和16SrRNA鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。通过温度、pH值和蛋白酶等因素分析,结果表明菌株LP1-4无细胞上清液(cell-free supernatant,CFS)中抑菌物质具有良好的热稳定性,在pH2.5～5.0具有抑菌活性,且对蛋白酶敏感,初步判断为细菌素类抑菌物质。菌株LP1-4在最佳培养时间24 h时抑菌活性达到峰值,应用乙酸乙酯萃取后抑菌圈直径达25.42 mm。采用Labscale TFF System超滤分离和Sephadex G-25凝胶层析获得小于1.0 ku分子质量的细菌素。经高效液相色谱纯化分析,抑菌物质在液相分离条件下目标峰的保留时间为5.0 min。采用基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱确定细菌素分子质量为0.854 ku,其氨基酸排列顺序为谷氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-赖氨酸(ENKPAAPK)。本研究从大菱鲆肠道筛选具有广谱抗菌活性的菌株LP1-4,对研发控制水产品腐败菌和致病菌的乳酸菌生物防腐保鲜制剂具有潜在的应用价值。

降解嗜水气单胞菌群体感应AHLs信号分子的乳酸菌筛选及淬灭作用

AHLs是一类介导革兰氏阴性菌群体感应的氮酰基高丝氨酸内酯类信号分子,从自然界中寻找对AHLs具有降解活性的乳酸菌,探究应用乳酸菌群体感应抑制剂控制致病菌的新途径。采用96孔板法从传统发酵食品和海水鱼肠道中分离的156株乳酸菌中初筛到56株对嗜水气单胞菌群体感应AHLs具有降解作用的菌株,初筛率为35.90%。采用琼脂扩散法对初筛菌株复筛得到12株降解活性较强的乳酸菌,其中来源于牙鲆肠道的菌株YP 4-1-1降解活性接近100%。GC-MS分析表明:菌株YP 4-1-1对嗜水气单胞菌C4-HSL和C6-HSL信号分子的降解活性分别为98.31%和81.81%。经生理生化和16S rRNA序列分析确定菌株YP 4-1-1为清酒乳杆菌。菌株YP 4-1-1酶解AHLs的活性来源于其粗细胞提取物的可溶性部分,可能是一种AHLs-酰基转移酶或氧化还原酶。YP 4-1-1粗提物对紫色杆菌CV026和嗜水气单胞菌的MIC分别为2.0 mg/mL和4.0 mg/mL,3个不同亚MIC(0.25 MIC,0.50 MIC,0.75 MIC)对紫色杆菌素的降解作用具有剂量依赖性。在体外共培养试验中,菌株YP 4-1-1可减弱嗜水气单胞菌溶血性、蛋白酶、DNA酶和嗜铁素等毒力因子的表达,并对其群体感应的群集和泳动行为具有抑制活性。本文从自然生态环境中获得对革兰氏阴性菌AHLs具有降解活性的乳酸菌,为研发乳酸菌生物制剂控制革兰氏阴性菌导致的水产动物疾病奠定理论和应用基础。