芦丁-α-鼠李糖苷酶基因的克隆

根据芦丁 α 鼠李糖苷酶N端氨基酸序列设计简并引物,从Absidiasp.R9g的总RNA出发,通过逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)扩增出芦丁 α 鼠李糖苷酶基因片段。将RT PCR获得的1条1.6kb的目的条带与pMD18 T载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞。酶切鉴定结果表明目的片段克隆成功。

瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ及其CBD的噬菌体表面展示系统的构建

为研究纤维素酶的酶活性和吸附特性之间的关系,将瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅰ(endoglucanaseⅠ,EGⅠ)和其吸附结构域(cellulose-binding domains,CBD)的基因经PCR扩增后,连接到载体pCANTAB5E上,构建成噬菌粒展示载体pCANTAB5E-egⅠ和pCANTAB5E-egⅠ-cbd。将这些噬菌体展示载体转化到大肠杆菌TGⅠ中,在辅助噬菌体M13KO7的帮助下得到重组噬菌体。用ELISA和Somogyi方法分别测定了EGⅠ及其CBD的表面展示噬菌体对纤维素的亲和性和EGⅠ的CMC活性,结果显示EGⅠ及其CBD已功能展示于噬菌体表面。该系统的成功构建为今后利用噬菌体展示的方法进行纤维素酶的酶分子改造提供了基础。

冰川消退带微生物群落演替及生物地球化学循环

冰川是生物圈重要组分之一。由于全球气候变化世界多地冰川加速消融,暴露原本被冰盖覆盖的区域,这些区域被称为冰川消退区域(glacier retreat area)或冰川前部区域(glacier foreland)。自暴露开始消退区随即发生初生演替,随着演替进行,物质循环逐步建立,生物量和土壤C、N总量逐步增加。生态系统C、N输入最初以矿化外来物为主,逐渐转变为以生物固C、固N为主。演替早期生态系统的发育主要受土壤C、N含量的限制,而演替后期的限制性营养物转变为P。演替区域土壤逐渐发育并促进生态位的分化,细菌、真菌、古菌,病毒及其他微生物群落的生物量和多样性不断增加直至达到该地区可承受的极值。随着生存条件的改善,不同生态策略物种的更替导致每个演替阶段微生物群落结构的差异。整体上,伴随演替进行微生物群落丰度、结构和活性呈现梯度性变化。气候变化对冰川消退带生态演替结果产生多方面的影响,而这些影响结果又综合反馈气候变化,因此目前难以准确估计气候变化对消退带生态演替的净效应。综述了近年冰川消退带微生物群落演替方面相关的研究结果,同时分别对该区域物质循环的建立、微生物群落演替和气候变化造成的影响这三个方面进行详细描述,并指出当前研究的不足。

双偶氮染料的茶渣固态漆酶脱色

利用变色栓菌茶渣固态发酵制备的茶渣固态漆酶对双偶氮类染料进行脱色,并以直接耐晒黄RS为代表,研究其脱色机制和脱色效果。结果表明,在茶渣固态漆酶用量为160 U/L、染料质量浓度为100 mg/L条件下反应2 h后,直接耐晒黄RS的脱色率达到81.10%。研究发现,茶渣固态漆酶的脱色机制包括游离漆酶降解、茶渣吸附和固定化漆酶降解三部分,对直接耐晒黄RS的脱色率分别为16.40%、43.20%和19.70%。茶渣固态漆酶在染料脱色中表现出较好的重复使用性能,重复利用4次,脱色率仍保持在50%以上。毒性检测结果表明,绿豆种子的萌发率从36.67%提高到85%,脱色后染料溶液毒性明显下降。利用茶渣固态漆酶对染料脱色具有时间短、效率高、可重复利用和成本低等优势,在染料脱色方面具有良好的前景。

贝莱斯芽孢杆菌B6强化驱油机制分析及在高矿化度油藏中的应用

【目的】筛选油藏内源功能微生物并探究其驱油机理,现场试验以确定油藏内源微生物提高原油采收技术应用的工艺和技术可行性。【方法】采集英东油田样品,利用原油平板筛选驱油功能菌,评价其环境适应性并优化培养条件,通过乳化性能、降黏防蜡和烃转化能力等评估其驱油性能并探索其潜在机制,并在油田现场进行微生物强化驱油试验。【结果】从油水样品中分离到的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)B6,其乳化活性指数(emulsifying activity index,EI24)值为100.00%,降黏率为97.20%,防蜡率为86.90%,表明菌株B6具有良好的乳化降黏性能,具有提高原油采收的潜力,并且能够减少原油中的重质组分而增加轻质烃类,改善原油物性,提升原油品质。进一步在英东油田、跃进油田和花土沟油田进行微生物单井吞吐和清防蜡作业,共进行62井次现场试验,累计增油1460.36 t,平均延长洗井周期47 d,经济效益为342.50万元,投入产出比为1:4。【结论】通过室内研究和现场试验,证实内源微生物Bacillus velezensis B6具有显著提高原油采收和油井清防蜡的效果,应用潜力巨大。

基于QMEC分析的青藏高原不同类型冰川前缘地土壤微生物功能潜力

微生物通过多种功能代谢过程主导着因气候变暖裸露的冰川前缘地土壤元素的地球化学循环.以青藏高原的海洋型冰川、亚大陆型冰川和极大陆型冰川的前缘地土壤为研究对象,分析不同类型冰川前缘地土壤的微生物功能特征.依次选择玉龙冰川、天山乌鲁木齐1号冰川和老虎沟12号冰川作为三类冰川的典型代表,采用高通量功能基因芯片(QMEC)检测土壤微生物的功能基因特征.结果表明,在三类冰川前缘地土壤中,半纤维素降解基因和还原型乙酰辅酶A途径相关的碳固定基因丰度最高,三者主要的氮功能基因和氨化作用有关,磷、硫功能基因则主要与有机磷矿化过程和硫氧化过程相关.其中,水热条件较好的海洋型冰川的微生物功能基因的种类与丰度最高,其次为环境较为干燥的极大陆型冰川.三类冰川前缘地土壤的微生物功能基因结构的显著差异,证实了地理环境差异对微生物功能特征的影响,也为不同类型冰川前缘地土壤微生物的功能及其介导的元素地球化学循环研究提供了基础.

利用PCR-DGGE分析未开发油气田地表微生物群落结构

利用PCR-DGGE和克隆测序技术,分别对未开发油田、气田和非油气田对照区域,地表30、60、100、150、200 cm深度的土壤微生物分布进行研究,目的在于了解未开发油气田区域土壤微生物的分布特征,寻找潜在的油气资源指示菌.结果表明,不同深度土壤样品间的菌群相似度很低(26～69.9).在150 cm和200 cm处,DGGE图谱具有更好的丰富度(≥19)、多样性(≥2.69)和均匀度(≥0.90).油田区域富含γ-Proteobacteria(75%),此外还包括α-Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria,其相似菌株主要为石油相关菌和烃降解菌,如食烷菌、噬甲基菌.气田含有α、β、γ、δ-Proteobacteria和Bacteroidetes,γ-Proteobacteria含量较小(24%),所获16S rDNA条带相似菌株大多不具有烃降解能力,部分具有甲烷相关性,如甲基孢囊菌.在此类研究中,150 cm、200 cm更适于作为统一取样深度进行大范围取样调查;甲基孢囊菌可用来作为潜在的气田指示菌,食烷菌和噬甲基菌可作为潜在的油田指示菌,但仍需进一步地大范围取样验证.

未开发油气田地表烃氧化菌空间定量分布

利用Real-time PCR技术,分别对非油气田对照区域、未开发油田、未开发气田地表30、60、100、150、200 cm深度的甲烷氧化菌、C5～C16烃氧化菌进行定量研究,目的在于加深对该类型区域烃氧化菌空间分布特征的了解,为微生物油气勘探技术的发展提供基础资料.结果表明,气田区域甲烷氧化菌(pmoA)含量为1.34E+04～3.90E+05 copies.g-1,并随深度的加深逐渐减少;油田仅为3.14E+02～4.32E+03 copies.g-1.100～200 cm深度,油田C5～C16烃氧化菌(alkB)含量为1.38E+07～3.61E+07 copies.g-1,高于等深度对照(4.24E+06～2.14E+07 copies.g-1)和气田区域(5.82E+06～3.52E+07copies.g-1).甲烷氧化菌分布受全氮、有机碳、pH影响显著,相关系数分别为0.859、0.631、-0.549,而C5～C16烃氧化菌分布受环境因素影响相对较小.100～200 cm深度范围内,该区域全氮、有机碳、pH等理化因素相对稳定,烃氧化菌含量在不同深度间差异较小.因此,本研究表明,气田区域具有明显的甲烷氧化菌异常,油田在100 cm以下深度具有一定的C5～C16烃氧化菌异常;100～200 cm更适于作为统一取样深度进行大范围定量调查,但仍需要进一步的验证.

利用DGGE-菌落原位杂交法分离土壤中精喹禾灵降解菌

从自然环境中分离到的可降解农药的土著微生物,因其对环境的友好性及原位修复的可行性,受到了高度关注.为从土壤中筛选精喹禾灵降解菌株,首先利用PCR-DGGE技术分析了除草剂精喹禾灵胁迫下土壤细菌群落结构及多样性的变化.结果表明,添加精喹禾灵后,土壤细菌群落结构发生了明显的改变.精喹禾灵使细菌多样性呈现出增加-减少-增加的变化趋势,其中第9 d变化最大,后期趋于稳定.根据DGGE图谱条带的测序结果推断,Pseudomonas、Massilia、Burkholderia等属中的细菌对精喹禾灵具有耐受性或降解潜力,这些微生物类群可作为减少农药残留的土著微生物资源进行分离筛选.根据条带的测序结果,合成了地高辛(Digoxigenin)标记的探针,并进行了菌落原位杂交,筛选到了3株具有降解潜力的菌株,其中L1可以利用精喹禾灵作为唯一碳源生长,经16S rRNA基因鉴定该菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.).利用高效液相色谱法测定了菌株L1在无机盐培养基中降解精喹禾灵的效果.结果表明,培养7 d后,精喹禾灵的含量减少了近50%,且随着精喹禾灵含量的降低,L1菌体数量增加,证实了菌株L1具有降解精喹禾灵的能力.这一结果为今后研究菌株L1降解精喹禾灵的机制、功能基因等奠定了基础.

转Cry1Ac基因抗虫棉与其亲本棉花根际真菌多样性的比较

在温室条件下,利用PCR-DGGE技术和Q-PCR技术分析了两种转Cry1Ac基因抗虫棉及其亲本棉花在不同取样时期的根际真菌多样性和生物量的动态变化情况,以评价其生态安全.结果表明,转Bt基因棉与对照棉根际真菌优势条带组成在不同的取样时期极为相似,三者间差异条带多为不清晰的条带.转Bt棉SGK321根际真菌的生物量在苗期明显低于亲本对照,转Bt棉XP188根际真菌的生物量在花铃期较对照有轻微降低,其它时期两种转Bt棉根际真菌生物量没有显著降低,甚至还有增加的趋势.不过根际真菌群落结构的改变和生物量的差异不仅存在于转基因棉和其亲本对照棉之间,它同样存在于对照棉SHIYUAN321和JM20之间以及转基因棉SGK321和XP188之间.可见Bt并不是造成转基因棉和非转基因棉根际真菌群落结构差异、多样性改变和生物量减少的唯一诱因,品种的不同也对它们也有影响.

降解纤维素产甲烷的四菌复合系

自然环境中通常是微生物群落协同完成纤维素的降解,构建可降解纤维素的混菌体系是认识微生物相互作用的关键.利用富集培养法,结合变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹检测技术以及厌氧滚管技术,建立了一种筛选简单降解纤维素产甲烷复合菌系的方法.利用此方法从青藏高原若尔盖高寒湿地分离到一个由4株菌构成的降解纤维素产甲烷的稳定菌系.结果表明,该复合菌系由纤维素水解菌Clostridium glycolicum、非纤维素水解菌Trichococcus flocculiformis和Parabacteroides merdae、产甲烷古菌Methanobacterium subterraneum等具有不同功能的4种菌株组成,且在这4株菌的共同作用下可将纤维素直接转化为CH4.该简单复合系的获得为今后纤维素转化甲烷复合菌系的代谢控制和遗传改造提供了一个平台.

微生物全细胞传感器在重金属生物可利用度监测中的研究进展

传统的物理化学方法主要用于测定环境重金属的总量,微生物全细胞传感器可以对土壤及水体环境的重金属生物可利用度进行监测.此外,微生物全细胞传感器还具有操作简单、快速、经济的特点,适用于污染事件的应急监测.微生物全细胞传感器的生物学元件主要由MerR、ArsR、RS等家族的金属调控蛋白和gfp、lux、luc等报告基因组成.调控蛋白、报告基因与微生物全细胞传感器的灵敏度、特异性和监测特点有关.受pH、金属螯合物及检测条件等因素的影响,不同的环境条件下的重金属生物可利用度是不同的.增加重金属在微生物细胞内的累积,进行调控蛋白的分子生物学改造,优化检测条件是提高传感器灵敏度、特异性和准确性的可行方案.实现污染物的原位和在线监测是微生物全细胞传感器的主要发展方向.

全氟辛烷磺酸生物降解研究进展

全氟化合物(perfluorinated compounds,PFCs)是碳氢类化合物及其衍生物中氢原子全部被氟原子取代后形成的一类化合物。全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate,PFOS)是一种典型的全氟化合物,对于生物具有多方面的毒性。研究发现,PFOS广泛存在于环境中,造成了一定的污染,PFOS的降解成为亟待解决的问题。但是由于PFOS稳定性高,降解较为困难,尤其是在生物降解方面的研究较少。本文主要介绍了PFOS降解技术的发展现状以及存在的问题,并提出PFOS生物降解的可能途径。

北京和保定地区大气细颗粒物中可培养细菌的种群特征

在北京城区和河北省保定郊区(望都),于2015年1月10~17日雾-霾时期,使用大气颗粒物采样器收集大气细颗粒物(PM2.5),比较了两地雾-霾时期PM2.5中可培养细菌的种群结构特征异同;使用场发射扫描电镜(FESEM)观察PM2.5颗粒形态,利用后向轨迹模型NOAA/ARL HYSPLIT-4分析北京城区和保定郊区气团输送来源,采用离子色谱仪、流动分析仪和ICP-MS仪器监测PM2.5中主要水溶性离子和重金属元素含量.结果表明,北京城区和保定郊区分离得到的PM2.5可培养细菌为厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和α-变形菌门(α-Proteobacteria)三大菌门,其中厚壁菌门(Firmicutes)为优势菌门;分离纯化鉴定出17种细菌,革兰氏阳性菌占90%以上;优势菌属为产芽孢的芽孢杆菌属(Bacillus),分别占北京城区(RCEES)和保定郊区(WD)PM2.5样品中可培养细菌百分比的68.15%和75%.北京城区和保定郊区PM2.5中可培养细菌种群结构特征可能受到PM2.5理化性质和气团传输的影响.

合成微生物体系研究进展

合成微生物体系作为自下而上构建的人工合成微生物群落,相比于自然微生物群落具有复杂度低及可控性、可操作性强等特点。其作为新兴的生物技术,综合借鉴了合成生物学、系统生物学、生物进化等知识,通过合理的设计、规划与调控,成为研究微生物生态学理论的实验平台,以及验证已知理论的微生物系统。本文首先简单介绍了合成微生物体系的概念及其由来,阐述了其基本构建原则,随后介绍了其生态学理论基础,并总结概括了近年来的实际应用,最后提出合成微生物体系的发展前景,包括需要设计构建更为复杂的人工合成微生物群落,以及优化生态模型。

纳米零价铁耦合假单胞菌协同高效降解五氯苯

【背景】氯苯类化合物广泛应用于工业化合物的生产,由于其具有高毒性和环境持久性的特点,对人类健康和生态环境造成严重威胁,寻找高效降解这类化合物的新方法成为研究热点。【目的】将纳米零价铁与假单胞菌耦合,探究其在好氧条件下对五氯苯的降解效果和降解机理。【方法】建立纳米零价铁和假单胞菌降解五氯苯的反应体系,通过测定各反应体系中五氯苯及其中间产物的浓度,以及观测细菌的生长状况变化等,分析反应体系的降解效果及其可能的降解机理。【结果】纳米零价铁耦合假单胞菌的反应体系相对于两者的单一体系表现出更好的降解效果,36h的降解率可达55.4%,反应过程符合伪一级反应动力学,速率常数为0.02048h-1。根据GC-MS所测的中间产物推测,该体系的反应机理为纳米零价铁在好氧条件下反应产生羟基自由基,攻击五氯苯使其变为低氯苯类化合物,假单胞菌进一步利用这些低氯苯类化合物;同时,假单胞菌又为纳米零价铁提供附着位点,有效地降低了纳米零价铁的聚集性,提高了反应活性。【结论】研究建立的纳米零价铁耦合假单胞菌反应体系对五氯苯具有较好的降解效果,为含有高氯代苯类等有机污染物的复杂环境的修复提供参考。

固定化条件对苯系物细胞传感器检测效果的影响

利用海藻酸钠作为包埋剂对苯系物细胞传感器Pseudomonas fluorescens A506(pTS)进行固定化处理,并对细胞浓度、固定化时间、投加量等检测因素进行了优化.固定化后的细胞与游离细胞对苯系污染物的检测效果进行对比.经过2 h固定化处理的细胞传感器,在检测时间1.5～6.0 h内,信号上升速度为游离细胞的2.26倍,信号最大值为游离细胞的2.23倍.固定化处理后的细胞生长缓慢,且浓度远低于游离细胞,说明了固定化处理后的单位细胞信号强度增加.同时,细胞浓度随着固定化时间的延长而降低.在影响因素方面,细胞浓度和固定化时间对于检测信号的影响较大.固定化后,对高浓度的苯系污染物有着更快的信号响应.

Cr^(6+)生物可利用度检测的微生物全细胞传感器CB10的构建及其响应特征

为实现重金属污染环境中Cr6+的生物可利用度评价,进而为Cr6+的污染治理提供可靠依据,本研究采用分子生物技术,以重金属广谱抗性菌株Cupriavidus metallidurans CH34的pMOL28质粒上铬抗性调控系统的启动子和调控蛋白基因为传感器调控元件,以北美萤火虫Photinus pyralis的萤火虫荧光素酶基因luc为报告基因构建了一种可对Cr6+生物可利用度进行检测的微生物全细胞传感器CB10,并探究了其在不同检测条下的响应特征.结果表明,微生物全细胞传感器CB10在30 min内即可响应一定浓度的Cr6+;其对Cr6+的检测最低限LOD为2μmol·L-1;当Cr6+的浓度为20～200μmol·L-1时,CB10的响应能力与Cr6+浓度线性相关,进而传感器CB10可对该范围内的Cr6+生物可利用度进行定量分析(R2=0.980 55);当重金属诱导浓度为10～50μmol·L-1时,CB10对Cr6+具有较强的响应特异性;本研究也发现,较高浓度的Pb2+、Mn2+和Sb2+也可以产生对CB10的诱导能力;诱导温度为30℃,pH为7时,CB10的响应效率最高;诱导温度为15～30℃,pH为4～7时,CB10响应能力表现稳定.CB10具备较强的响应速率、灵敏度、特异性和稳定性,具备对水体重金属进行快速检测和土壤重金属的生物可利用进行评价的潜力.

模拟升温对冰川前缘地微生物种群的影响

由于全球变暖影响,冰川处于不断退缩状态.本研究以天山乌鲁木齐河源1号冰川前缘地3个不同退缩年代的土样为研究对象,设置2个温度处理,分别为5℃与15℃,通过150d室内培养实验,探讨升温对冰川前缘地微生物种群的影响.结果表明,在原始样品中,随土壤样品退缩年代的增加,土壤总碳氮含量增加,微生物的数量及α多样性增加.150d培养实验结果表明:细菌、古菌拷贝数随升温发生变化,但改变未达显著水平.此外,升温改变微生物群落结构,且对不同样点微生物群落结构影响不同.通过对升温后变化显著的优势OTUs进行分析,退缩年代较短的样点对升温响应更为明显,主要表现为Thiobacillus属相对丰度的升高.结果表明,冰川前缘地微生物对变暖响应的土壤异质性,其结果可为高山冰川地区升温下微生物的特征变化提供参考信息.

Zn(Ⅱ)对好氧反硝化菌Acinetobacter sp.JR-142的代谢活性影响

【目的】研究不同Zn(Ⅱ)浓度对好氧反硝化菌Acinetobacter sp.JR-142生理活性,尤其是反硝化代谢特性的影响。【方法】筛选一株好氧反硝化菌,优化了最佳活性条件;分析了不同Zn(Ⅱ)浓度对生长曲线和反硝化效率的影响以及对细胞形态的影响;明晰了不同Zn(Ⅱ)浓度条件下,细胞特征活性酶-硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的活性变化情况,分析了不同活性同关键酶的编码基因napA和nirS的相对表达量之间的规律。【结果】获得一株具有好氧反硝化功能的菌株,命名为JR-142,经鉴定为不动杆菌Acinetobacter sp.。在以琥珀酸钠为碳源,C/N为6,pH为7.0,温度30℃,转速为180 r/min的条件下,好氧反硝化活性最高。结果表明当Zn(Ⅱ)浓度为3.25 mg/L时,对菌株的生长及好氧反硝化速率有促进作用;当Zn(Ⅱ)浓度为52 mg/L以上浓度时,菌株的生长及反硝化速率均受到抑制。酶活及关键基因napA、nirS的定量分析结果显示,对照组及JR+0.05处理组的硝酸盐还原酶NR、亚硝酸盐还原酶NiR活性均高于JR+0.8处理组,在24 h时,JR+0.05 Zn(Ⅱ)处理组中,细胞的关键好氧反硝化基因napA及nirS的相对表达量显著高于对照组,这进一步说明3.25 mg/L Zn(Ⅱ)可以促进好氧反硝化过程,而在24 h及32 h时对照组及JR+0.05处理组的基因相对表达量远高于JR+0.8处理组,也说明52 mg/L Zn(Ⅱ)则会对反应产生抑制。【结论】探究并系统分析了不同Zn(Ⅱ)浓度对不动杆菌Acinetobacter sp.JR-142生长繁殖以及和在重金属锌离子存在的情况下影响好氧反硝化生理活性的影响,为后续硝酸盐-重金属复合污染废水的生物处理技术提供了数据指导。