羊毛硫细菌素bovicin HJ50修饰酶BovM双功能域单独催化活性鉴定

【目的】体外重建羊毛硫细菌素bovicin HJ50修饰酶Bov M双功能域(脱水酶与环化酶功能域)各自的催化活性,为深入了解Bov M催化机制奠定基础。【方法】在大肠杆菌(Escherichia coli)中分别异源表达纯化Bov M含脱水功能域的N端与含环化功能域的C端重组蛋白,构建体外反应体系,分别对其前肽底物Bov A进行修饰,通过产物抑菌活性及MALDI-TOF MS分子量检测来鉴定两者的修饰活性;并通过体内体外两种方法检测双功能域蛋白之间的协同作用。【结果】Bov M的N端脱水功能域及C端环化功能域分别具有脱水与环化活性,但双功能域重组蛋白之间没有协同作用。【结论】Bov M双功能域均可独立行使各自的催化功能,但Bov M的完整结构对其正常的催化活性非常重要。

A群C群脑膜炎球菌多糖-白喉毒素无毒突变蛋白CRM 197结合疫苗的稳定性

目的分析以白喉毒素无毒突变蛋白CRM197为载体的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗原液及成品在不同储存条件下主要质量指标的变化,为该疫苗保存条件及有效期的制定提供依据。方法将A群、C群结合物原液分别在2~8℃放置3、6、8个月,20~25℃放置4、6周后,进行主要质量指标的检测;结合疫苗成品于2~8℃放置3、6、12、18、24个月,20~25℃放置3、6个月,35~37℃放置3、4周后,进行主要质量指标的检测。结果C群结合物原液2~8℃保存8个月,20~25℃放置6周后,A群结合物原液2~8℃放置8个月,20~25℃放置3周后,各项质量指标均符合要求;成品于2~8℃放置24个月,20~25℃放置6个月,35~37℃放置4周后,各项质量指标均符合要求。结论以CRM197为载体的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗原液及成品均具有良好的质量稳定性。

棒状链霉菌中隐性羊毛硫肽CLA 124的半体外生物合成

【目的】利用半体外生物合成方法获得棒状链霉菌中的隐性羊毛硫肽,为放线菌中羊毛硫肽资源的挖掘提供借鉴。【方法】利用nisin修饰系统,在大肠杆菌(Escherichia coli)中对隐性羊毛硫肽的核心肽进行体内修饰。修饰后产物经亲和层析和高效液相色谱(HPLC)纯化后,体外酶切反应切除前导肽,利用MALDITOF MS检测核心肽的脱水情况,并结合二级质谱解析其成环结构。【结果】获得了新的羊毛硫肽CLA 124,其核心肽脱去了4分子水,并形成2个硫醚键和一个二硫键。【结论】半体外生物合成方法可用于放线菌来源隐性羊毛硫肽的资源挖掘。

不同分子大小b型流感嗜血杆菌结合物免疫原性的比较

目的评价不同分子大小b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)结合物的免疫原性,确定结合物的最适分子大小。方法制备不同活化度的Hib多糖,分别与载体蛋白CRM197以胺还原法制备不同分子大小(K_D)的Hib结合物;此外,利用凝胶过滤层析分离Hib结合疫苗原液,收集K_D于0.05~0.25、0.25~0.45之间及大于0.45的结合物组分;分别免疫小鼠,采用间接ELISA法测定小鼠血清中抗Hib多糖IgG抗体滴度,以市售Hib疫苗作为对照。结果不同分子大小Hib结合物第2针及第3针免疫后,K_D0.35组与K_D0.01组诱导的抗体水平相当(P=0.166和0.882),显著高于K_D0.53组(P=0.008和0.031),也高于对照疫苗组;同样K_D0.25组第2针免疫后诱导的抗体滴度也显著高于K_D0.48组(P=0.037)。不同分子大小片段的Hib结合物组分第2针及第3针免疫后,K_D0.05~0.25组抗体水平最高,K_D0.25~0.45组次之,K_D>0.45组最低。结论较高分子大小Hib结合物的免疫原性优于较低分子大小的结合物,在制备Hib结合疫苗时,以分子大小K_D0.20~0.35为宜。

多糖结合疫苗中残余CDAP检测方法的建立及验证

目的建立测定多糖结合疫苗中残余1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟化硼(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate,CDAP)的高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC),为多糖结合疫苗的质量监控提供依据。方法 HPLC色谱条件:色谱柱:TSK gel ODS-100V(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:乙腈-水-三氟乙酸(60∶40∶0.1);检测波长:300 nm;流速:1 ml/min;进样体积:15μl;理论塔板数按CDAP峰面积计算不低于2 000。以峰面积对浓度进行线性回归,确定该方法的线性范围,并对该方法进行专属性、检测限、定量限、精密度、稳定性及准确度验证。结果该方法检测CDAP专属性良好,最低检测限和定量限分别为35 ng/ml和40 ng/ml;CDAP浓度在160~4 000 ng/ml范围内,标准曲线的线性关系良好,R^2=0.999 9;供试品和CDAP标准品连续6次进样,RSD分别为0.26%、0.57%;供试品在8 h内稳定,平均加样回收率为94.5%,RSD为2.5%。结论建立了测定多糖结合疫苗中残余CDAP含量的HPLC测定方法,该方法准确、简便、可靠,能有效控制多糖结合疫苗的质量。

两种方法制备的C群脑膜炎球菌多糖CRM_(197)蛋白结合物生物学特性、热稳定性及免疫原性的对比

目的分析两种方法制备C群脑膜炎球菌多糖CRM_(197)蛋白结合物的主要生物学特性,并对比其热稳定性和免疫原性,选择适用于C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法。方法采用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化C群多糖,经己二酸二酰肼(ADH)衍生后,在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDAC)的催化作用下与CRM_(197)共价结合,获得结合物CPS_(_CDAP)AH-CRM_(197);将C群多糖不经活化直接通过ADH衍生后,在EDAC的催化下与CRM_(197)共价结合,获得结合物CPS_(_EDAC)AH-CRM_(197)。对两种方法制备结合物的多糖含量、游离多糖含量、蛋白含量及多糖衍生度等生化指标进行测定,并计算多糖利用率;将结合物分别于37℃放置2周、3周,20～25℃放置4周和8周后取样,测定游离多糖含量;将两种方法制备的结合物免疫小鼠后,检测小鼠血清中C群多糖IgG抗体水平;体外杀菌试验评价结合物的功能性杀菌抗体水平。结果结合物CPS_(_CDAP)AH-CRM_(197)的多糖衍生度较低,游离多糖含量较高,平均多糖利用率为12.2%,于37及22～25℃温度下保存稳定性较差;结合物CPS_(_EDAC)AH-CRM_(197)的多糖利用率比前者高近2倍,游离多糖含量较低,在37和22～25℃温度下保存均表现出良好的热稳定性(游离多糖含量均未超过5%)。CPS_(_EDAC)AH-CRM_(197)组小鼠血清IgG抗体水平显著高于CPS_(_CDAP)AH-CRM_(197)组(P<0.05),但两者诱导的杀菌抗体水平相当(P>0.05)。结论C群多糖不经活化直接与蛋白结合的方法更适用于C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备。