小檗碱对结核抗原持续刺激致T细胞耗竭的干预作用

目的探究小檗碱对结核分枝杆菌抗原持续刺激致T细胞耗竭的影响。方法应用结核抗原持续刺激小鼠模拟临床结核分枝杆菌慢性感染病理过程:卡介苗感染C57BL/6小鼠1周后,使用结核抗原ESAT6-CFP10(EC)和Mtb10.4-HspX(MH)持续刺激4次,每次间隔1周,建立T细胞耗竭模型。利用该模型进行干预治疗:结核抗原刺激期间每天给予不同剂量小檗碱灌胃治疗,末次抗原刺激后1周,流式细胞术检测抗原特异性T细胞分泌γ干扰素的水平和脾脏CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞表面抑制性受体PD-1的表达;ELISA检测血清中γ干扰素的水平;生化试剂盒检测脾脏淋巴细胞糖酵解代谢产物丙酮酸和乳酸的浓度;小檗碱体外作用于Jurkat T细胞后检测丙酮酸和乳酸的浓度。结果结核抗原持续刺激致抗原特异性T细胞分泌γ干扰素的水平降低(P<0.05),CD4^(+)和CD8^(+)T细胞表达PD-1增多(P<0.05),提示发生T细胞耗竭。不同剂量的小檗碱治疗后,减弱了T细胞的持续活化,血清γ干扰素水平降低(P<0.01),CD4^(+)和CD8^(+)T细胞PD-1表达减少(P<0.05)。体外实验表明小檗碱抑制Jurkat T细胞的糖酵解(P<0.01)。结论结核抗原持续刺激诱导T细胞耗竭,而小檗碱治疗可抑制T细胞的糖酵解,调节T细胞活化,预防T细胞耗竭。

结直肠癌中K-ras基因突变与TAK1、MAP4K2蛋白表达的相关性研究

目的分析K-ras基因突变、转化生长因子激酶1(TAK1)蛋白和MAP4K2蛋白的表达与结直肠癌临床病理特征的关系,并分析K-ras基因突变与TAK1、MAP4K2蛋白表达的相关性。方法应用DNA测序法检测76例结直肠癌样本中K-ras基因突变情况,应用免疫组化法检测样本中TAK1和MAP4K2蛋白表达情况。结果76例结直肠癌中,K-ras基因突变率为32.89%(25例),K-ras基因突变与肿瘤分化程度有关(P<0.05),与浸润深度、是否有淋巴结转移无关;TAK1阳性率为48.68%,MAP4K2阳性率为46.05%,TAK1蛋白表达和MAP4K2蛋白表达均与肿瘤分化程度、是否有淋巴结转移有关(P<0.05),与浸润深度无关。在76例结直肠癌中,K-ras基因突变与TAK1蛋白表达、MAP4K2蛋白表达均无相关性(P>0.05),TAK1蛋白表达与MAP4K2蛋白表达之间无相关性;在25例K-ras基因突变的结直肠癌中,TAK1蛋白表达与MAP4K2蛋白表达之间呈正相关(r=0.402,P<0.028)。结论 K-ras基因突变、TAK1和MAP4K2蛋白表达均与结直肠癌的肿瘤分化程度有关,与浸润深度无关;在K-ras基因突变的结直肠癌中,TAK1蛋白表达与MAP4K2蛋白表达之间呈正相关。

4EGI-1通过下调Bcl-2诱导K-RAS基因突变型结直肠癌细胞凋亡

目的:研究真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor4E,eIF4E)/eIF4G相互作用抑制剂4EGI-1对K-RAS基因突变型及野生型结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞HCT116和DLD1增殖和凋亡的影响,及可能的作用机制。方法:采用MTT法和FCM法检测不同浓度的4EGI-1对K-RAS基因突变型及野生型HCT116和DLD1细胞(HCT116^(KRASG13D)、HCT116^(KRASWT)、DLD1^(KRASG13D)和DLD1^(KRASWT))增殖及凋亡率的影响;蛋白质印迹法检测4EGI-1对HCT116^(KRASG13D)和HCT116^(KRASWT)细胞中凋亡相关蛋白caspase3和cleaved-caspase3及其底物多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly adenosine diphosphate-ribosepolymerase,PARP)和cleaved-PARP,以及Bcl-2家族中Bcl-2、Bcl-x L、Mcl-1、Bim、Noxa和Puma表达水平的影响。采用慢病毒感染的方法将特异性针对Bcl-2基因的sh RNA(sh Bcl-2)转入HCT116^(KRASWT)细胞,随后用蛋白质印迹法检测Bcl-2的敲减效率。再用MTT法和FCM法检测4EGI-1对敲减Bcl-2表达后HCT116^(KRASWT)细胞增殖及凋亡的影响,并用蛋白质印迹法检测其对HCT116^(KRASWT)细胞中凋亡相关蛋白PARP和cleaved-PARP表达水平的影响。结果:4EGI-1能明显抑制HCT116^(KRASG13D)、HCT116^(KRASWT)、DLD1^(KRASG13D)和DLD1^(KRASWT)细胞的增殖并呈一定的剂量相关性(P<0.05),且4EGI-1对K-RAS基因突变细胞增殖的抑制作用大于其对K-RAS基因野生型细胞增殖的抑制作用(P<0.05)。4EGI-1能明显促进HCT116^(KRASG13D)、HCT116^(KRASWT)、DLD1^(KRASG13D)和DLD1^(KRASWT)细胞的凋亡(P<0.05),且K-RAS基因突变型CRC细胞的凋亡率明显高于K-RAS基因野生型细胞(P<0.05)。蛋白质印迹法检测结果显示,4EGI-1能明显上调HCT116^(KRASG13D)和HCT116^(KRASWT)细胞中cleaved-caspase3和cleavedPARP蛋白的表达水平(P<0.05),且4EGI-1作用后明显地降低了HCT116^(KRASG13D)细胞中抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平(P<0.05)。Bcl-2在HCT116^(KRASWT)细胞中的表达水平明显高于其在HCT116^(KRASG13D)细胞中的表达水平(P<0.05),敲减Bcl-2基因表达后,与对照组相比,HCT116^(KRASWT)对4EGI-1抑制增殖和诱导凋亡的敏感度增加(P<0.05)。结论:4EGI-1能通过降低Bcl-2表达抑制K-RAS基因突变型CRC细胞的增殖并诱导其凋亡。本研究为4EGI-1作为潜在靶向药物在临床上对结直肠癌根据分子分型进行个体化治疗提供了理论基础。方法:采用MTT法和FCM法检测不同浓度的4EGI-1对K-RAS基因突变型及野生型HCT116和DLD1细胞(HCT116^(KRASG13D)、HCT116^(KRASWT)、DLD1^(KRASG13D)和DLD1^(KRASWT))增殖及凋亡率的影响;蛋白质印迹法检测4EGI-1对HCT116^(KRASG13D)和HCT116^(KRASWT)细胞中凋亡相关蛋白caspase3和cleaved-caspase3及其底物多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly adenosine diphosphate-ribose polymerase,PARP)和cleaved-PARP,以及Bcl-2家族中Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、Bim、Noxa和Puma表达水平的影响。采用慢病毒感染的方法将特异性针对Bcl-2基因的shRNA(shBcl-2)转入HCT116^(KRASWT)细胞,随后用蛋白质印迹法检测Bcl-2的敲减效率。再用MTT法和FCM法检测4EGI-1对敲减Bcl-2表达后HCT116^(KRASWT)细胞增殖及凋亡的影响,并用蛋白质印迹法检测其对HCT116^(KRASWT)细胞中凋亡相关蛋白PARP和cleaved-PARP表达水平的影响。结果:4EGI-1能明显抑制HCT116^(KRASG13D)、HCT116^(KRASWT)、DLD1^(KRASG13D)和DLD1^(KRASWT)细胞的增殖并呈一定的剂量相关性(P<0.05),且4EGI-1对K-RAS基因突变细胞增殖的抑制作用大于其对K-RAS基因野生型细胞增殖的抑制作用(P<0.05)。4EGI-1能明显促进HCT116^(KRASG13D)、HCT116^(KRASWT)、DLD1^(KRASG13D)和DLD1^(KRASWT)细胞的凋亡(P<0.05),且K-RAS基因突变型CRC细胞的凋亡率明显高于K-RAS基因野生型细胞(P<0.05)。蛋白质印迹法检测结果显示,4EGI-1能明显上调HCT116^(KRASG13D)和HCT116^(KRASWT)细胞中cleaved-caspase3和cleavedPARP蛋白的表达水平(P<0.05),且4EGI-1作用后明显地降低了HCT116^(KRASG13D)细胞中抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平(P<0.05)。Bcl-2在HCT116^(KRASWT)细胞中的表达水平明显高于其在HCT116^(KRASG13D)细胞中的表达水平(P<0.05),敲减Bcl-2基因表达后,与对照组相比,HCT116^(KRASWT)对4EGI-1抑制增殖和诱导凋亡的敏感度增加(P<0.05)。结论:4EGI-1能通过降低Bcl-2表达抑制K-RAS基因突变型CRC细胞的增殖并诱导其凋亡。本研究为4EGI-1作为潜在靶向药物在临床上对结直肠癌根据分子分型进行个体化治疗提供了理论基础。