鸡COL14A1基因的生物信息学分析及组织表达谱研究

为了分析肉鸡肢体内外翻畸形(valgus-varus deformity,VVD)致病候选基因COL14A1的生物信息学功能和组织表达谱,试验以6只35日龄的哈伯德肉鸡作为试验对象(正常组3只,VVD组3只),采用在线软件分析COL14A1基因核苷酸序列同源性、蛋白质基本理化性质和结构特征,利用实时荧光定量PCR法检测COL14A1基因在不同组织中的相对表达量,并绘制组织表达谱。结果表明:鸡COL14A1基因核苷酸序列和绿头鸭、日本鹌鹑的同源性最高;COL14A1蛋白理论等电点为5.25,不稳定指数为36.72,平均亲水性分值为-0.344分;COL14A1蛋白不存在跨膜结构,信号肽预测值为0.9862分,大于阈值0.5分;二级结构中的α-螺旋、β-转角、无规则卷曲和延伸链占比分别为17.27%、4.56%、55.88%、22.30%,其中无规则卷曲和延伸链占比较多;三级结构中存在着大量的无规则卷曲和延伸链;COL14A1基因在腿肌组织中相对表达量最低,在软骨和法氏囊组织中的相对表达量较高,并且VVD组肉鸡法氏囊组织相对表达量极显著低于正常组(P<0.01)。说明COL14A1基因在法氏囊组织中的差异表达可能是导致肉鸡发生VVD的关键原因。

科宝肉鸡养殖场肢体内外翻畸形腿病调查分析

为探究科宝肉鸡肢体内外翻畸形(valgus-varus deformity,VVD)的发病情况,本研究对河南某养殖场的科宝肉鸡VVD腿病进行跟踪调查,统计VVD肉鸡发病率、内外翻类型、步态评分和关节肿胀比例,并随机抽取2周龄、4周龄和5周龄严重畸形VVD肉鸡各5只,进行临床剖检和关节积液细菌检测。结果表明,VVD肉鸡的综合发病率为0.22%;前期双侧外翻VVD肉鸡显著多于单侧外翻(P<0.01),随着肉鸡日龄的增加,严重畸形的VVD肉鸡逐渐增加,关节肿胀占比逐渐增大,4周龄病鸡关节肿胀比例显著高于2周龄(P<0.05);对VVD肉鸡关节积液细菌培养和16S rDNA鉴定发现,积液中含有金黄色葡萄球菌和克雷伯菌。研究表明,科宝肉鸡VVD腿病综合发病率低于其他生长快速型肉鸡品种,1~2周龄发病率最高,肢体内外翻畸形程度随周龄的增加而加重,部分VVD肉鸡跗关节含有金黄色葡萄球菌和克雷伯菌。

日龄对肉鸡骨骼生长和小肠钙吸收关键基因表达的影响

为研究不同日龄对肉鸡体重、骨骼生长及十二指肠钙结合蛋白(CaBP-D28k)、钙离子转运ATP酶B1(PMCAlb)、细胞核维生素D受体(nVDR)、细胞膜维生素D受体(mVDR)等钙吸收关键基因表达的影响,将1日龄罗斯308肉鸡公雏96只随机分为8个重复,每个重复12只鸡。给肉鸡饲喂常规营养水平饲粮。在14、21、28、35、42日龄时,分别从每个重复中随机取出1只鸡,合计8只,空腹12小时后屠宰。刮取十二指肠黏膜,利用荧光定量qRT-PCR技术,分析钙吸收关键基因的表达水平。结果显示:①14~42日龄时,肉鸡体重随日龄增加而线性提高(P<0.001);②14~42日龄时,肉鸡股骨重量、长度、直径、灰分重量随日龄增加线性增加(P<0.001),但股骨灰分含量、钙含量、磷含量随日龄增加而线性降低(P<0.001);胫骨生长呈现类似趋势;③14~42日龄肉鸡小肠钙吸收关键基因CaBP-D28k、PMCA1b、nVDR、mVDR mRNA表达水平随日龄增加呈现先升高后降低的趋势,在28日龄达到最高峰;但CaBP-D28k mRNA表达水平在各日龄间差异不显著。结果表明:尽管14~42日龄肉鸡体重、股骨与胫骨重量、灰分重量线性增加;但股骨与胫骨灰分含量线性降低;而CaBP-D28k、PMCA1b、n VDR、mVDR等钙吸收关键基因表达水平呈现先升高后降低的趋势,在28日龄达到最高峰。研究提示:肉鸡小肠钙吸收能力随日龄而改变。

鸡软骨细胞体外分离培养鉴定以及过表达miR-15a对软骨细胞的影响

为分析miR-15a在肉鸡不同组织中的表达情况,并探究过表达miR-15a对体外培养鸡软骨细胞的影响。本研究首先通过倒置显微镜观察、PCR、凝胶电泳和甲苯胺蓝染色对体外分离培养的软骨细胞进行鉴定。通过实时荧光定量PCR检测miR-15a在肢体内外翻畸形(valgus-varus deformity,VVD)组和健康组肉鸡中(各3只)各组织的表达量。之后通过CCK8和EDU方法分析软骨细胞过表达miR-15a后细胞增殖情况。软骨细胞转染miR-15a mimics后,通过qPCR检测软骨细胞的标志基因Collagen-2、Aggrecan、Collagen-10,成熟分化基因Runx2、Sox9、VEGF、MMP9,炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β3以及凋亡基因Fas、FasL、Bcl-2的表达量。并构建FKBP53′UTR的野生型载体和突变型载体,通过双荧光素酶检测报告检测miR-15a与FKBP5的靶向关系。结果表明,本研究所用的胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶联合消化法成功分离得到状态良好的软骨细胞。荧光定量结果显示,miR-15a在各组织中均有表达,与健康组相比,miR-15a在VVD组的肝(P<0.01)、脾(P<0.05)、胸腺(P<0.01)中的表达量显著升高,在心和胸肌组织中的表达量显著降低(P<0.01)。CCK8与EDU分析结果显示,与NC组相比,过表达miR-15a组软骨细胞增殖速度显著降低(P<0.01),增殖细胞数量显著减少(P<0.01)。qPCR结果显示,与mimics NC组相比,miR-15a mimics组的软骨细胞标志基因Aggrecan、成熟分化基因Sox9、Runx2表达量显著降低(P<0.05),Fas基因表达量极显著上升(P<0.01),FasL基因和抗凋亡基因Bcl-2极显著下降(P<0.01)。成功构建了FKBP53′UTR野生型和突变型载体,双荧光素酶检测报告结果显示预测的靶基因FKBP5与miR-15a没有靶向关系。本研究成功分离并鉴定了鸡软骨细胞,过表达miR-15a抑制鸡软骨细胞增殖、成熟和分化并促进细胞凋亡。