猪胸膜肺炎放线杆菌转铁结合蛋白B F190A突变及免疫原性

猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是造成猪肺炎和胸膜炎的重要病原菌之一,其病死率高达80%~100%。为了寻找APP转铁结合蛋白B(transferrin binding protein B,TbpB)与猪转铁蛋白(transferrin,Tf)相互作用的关键氨基酸,以达到为APP铁摄取机制研究及相关疫苗开发奠定基础的目的,本研究在对野生型TbpB进行序列分析、三维结构建模、克隆的基础上,通过GRAMM-X分子对接软件在线预测APP TbpB与猪Tf结合的关键氨基酸,利用重叠延伸PCR(SOE PCR)技术构建突变质粒,ZYM-5052半乳糖自诱导培养基诱导大肠杆菌表达该突变蛋白后与猪Tf进行斑点结合试验,野生型TbpB、突变TbpB以及PBS分别免疫小鼠,采用间接ELISA法检测不同阶段小鼠血清中特异性抗体的水平。分子对接结果显示,预测的关键氨基酸为第190位苯丙氨酸,质粒测序结果显示,已成功将编码190位苯丙氨酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子;斑点结合试验结果显示,突变TbpB与猪Tf不再发生结合反应;小鼠免疫试验结果表明与野生型TbpB相比,突变TbpB可诱导产生更高水平的抗体;APP TbpB 190位苯丙氨酸在与猪Tf反应中起着关键作用,突变TbpB具有良好的免疫原性,为进一步研究TbpB的功能、结构以及开发相关疫苗奠定了理论基础。