α-synuclein C端截短体的胞内分布

目的研究α-synuclein的4种C端截短体胞内的表达分布情况。方法PCR法获得α-synuclein的4个C端截短体基因片段,分别克隆入pEGFP-N1载体,并转染MN9D细胞、PC12细胞及SH-SY5Y细胞,于Confocal荧光显微镜下观察α-synuclein 4个C端截短体胞内的表达分布情况。结果α-synuclein的不同C端截短体胞内分布明显不一致,表现为随着C端部分的增长,α-synuclein截短体向核分布的趋势增强。结论α-synuclein的胞内定位与其C端密切相关,并且整个C端序列都可能在其核分布中发挥重要作用。

Neurturin基因的克隆及其在Vero细胞中的表达

目的克隆Neurturin(NTN)基因,并在Vero细胞中表达。方法用RT-PCR方法扩增hNTN cDNA,并克隆至pcDNA3真核表达载体中,经Lipofectamine2000转染Vero细胞,挑选稳定表达克隆,用RT-PCR及免疫荧光分析鉴定,并对转染后细胞的形态及生长状况进行分析。结果重组质粒pcDNA3/hNTN转染Vero细胞后获得了稳定表达克隆,且有目的蛋白表达,转染后细胞形态和生长特性发生了一定改变。结论获得了稳定表达NTN蛋白的Vero细胞株,为其移植并进行帕金森病猴基因治疗动物实验奠定了基础。

稳定表达α-Synuclein 4种选择性剪接异构体的PC12细胞对神经毒性剂MPP^+的敏感性研究

目的研究稳定表达α-synuclein 4种选择性剪接体的PC12细胞对神经毒性剂MPP+的敏感性。方法 PCR获得α-synuclein的4个选择性剪切体,克隆入pcDNA3.1载体,转染PC12细胞,经G418筛选获得稳定表达这4个剪切体的PC12细胞株,采用细胞毒的方法检测这4个稳定细胞株对神经毒性剂MPP+的敏感性。结果同全长相比,去除外显子5的选择性剪切体α-synuclein114和α-synuclein98对神经毒性剂MPP+的敏感性升高,表现为细胞活力的降低。结论去除外显子5的选择性剪切体α-synuclein114和α-synu-clein98对神经毒性剂MPP+的敏感性明显升高。抑制外显子5的选择性剪切,从而抑制选择性剪切异构体α-synucle-in114和α-synuclein98的产生可能是阻止神经元退行性丢失的一种策略。

α-synuclein修饰与帕金森病的研究进展

α-synuclein基因是最早发现的与帕金森病(Parkinson's disease,PD)相关的基因,在部分家族性PD患者中存在该基因的突变。无论是家族性还是散发性PD,其特征性包涵体——Lewy小体的主要成分都是聚集的α-synuclein蛋白,从组成来看,α-synuclein的氨基酸序列中存在众多能被修饰的位点,并且在α-synuclein转基因鼠中也检测到了以磷酸化、硝基化以及泛素化形式存在的α-synuclein聚集体。α-synuclein的不同修饰可能影响其自身的聚集特性及毒性作用,进而在PD的发病进程中发挥重要作用。因此,探讨与PD相关的α-synuclein的磷酸化、硝基化及泛素化修饰,对于更清楚地了解α-synuclein修饰与PD间的关系有重要意义。

帕金森病的神经保护治疗

在过去的10年中,对帕金森病发生发展过程中的一些病理生理学特性的研究已经取得一些进展,现在的研究主要集中于对能够产生保护多巴胺能神经元及改变疾病病程的新一代治疗方式的研究上。一些革新的治疗方式已经在临床前及临床研究中得到了验证,包括对与疾病病程相关的基因进行基因打靶,对神经元的存活和功能发挥决定性作用的神经营养因子的应用,有神经保护作用的新一代的受体激动剂以及抗氧化、抗凋亡等治疗策略。这些研究成果也许为治疗帕金森病提供了新的思路并奠定一定的基础。本文就近年用于治疗帕金森病的一些理论和药物做一综述。

人类白细胞抗原部分基因多态性与丙型肝炎病毒感染相关性研究进展

国内外有关宿主遗传基因与疾病关系的研究成果表明,人类白细胞抗原(HLA)在宿主免疫系统的免疫应答过程中发挥着举足轻重的作用。机体受到病原体感染后,其对病原体的清除以及疾病转归方面表现出的不同,在很大程度上取决于个体间基因组的差异。大量研究证实,HLA多态性是与丙型肝炎病毒(HCV)的易感性和清除相关的一个宿主基因,我们就该研究领域的进展进行简要综述。

阿尔兹海默症转基因小鼠模型研究进展及评价

随着世界人口的老龄化,阿尔兹海默症已经成为严重威胁老年人健康的主要疾病之一,研究并建立可靠的阿尔兹海默症动物模型对于探明疾病的病因、发病机制及防治药物的开发均具有重要意义。本文就目前使用最为广泛和研究最为深入的转基因小鼠模型的病理、行为学变化特点及其在阿尔兹海默症研究中的应用和发现作一介绍。

不同年龄段雌性Wistar大鼠不同骨骼区域骨密度值的测定与比较

目的提供不同年龄段雌性Wistar大鼠不同骨骼区域骨密度参考值。方法选取30只SPF级雌性Wistar大鼠,分别在6月龄、10月龄、12月龄、24月龄和30月龄时,采用双能X线骨密度仪依次测量大鼠头部、上肢、大腿、躯干、肋骨、骨盆、脊柱及全身等骨骼区域的骨密度,并进行不同年龄段间和同一年龄段不同骨骼区域间骨密度值的比较。结果随着月龄的增加雌性大鼠头部、上肢、大腿、躯干、肋骨、骨盆、脊柱和全身骨密度值迅速增加至10月龄达到峰值;大鼠头部、上肢、大腿、躯干和肋骨部骨密度值均显著或极显著高于同月龄全身骨密度值(P<0.05或P<0.01),而骨盆和脊柱部骨密度值和同月龄全身骨密度值比较差异无显著性(P>0.05),相关性分析三者均呈显著正相关(P<0.01)。结论本文提供了雌性Wistar大鼠骨生物学指标的部分背景数据,为以Wistar大鼠为对象的骨代谢研究及其在生物医学领域的应用补充了基础参考资料。

非人灵长类动物体外受精-胚胎移植(IVF-ET)手术室建设及使用探讨

非人灵长类动物已广泛应用于与人类相关的生殖模型研究,而生殖和转基因操作相关手术室的硬件和软件建设是保证研究顺利开展的前提条件。因此,本文结合我中心的实际建设情况,就非人灵长类动物体外受精-胚胎移植相关手术室的合理建设及可能存在的问题等进行了探讨,为相关科研工作人员提供参考。

树鼩全基因组分泌蛋白的预测分析

目的综合了解树鼩的分泌蛋白的信息。方法利用真核生物分泌蛋白预测流程EuSecPred 2.0对树鼩的分泌蛋白进行全基因组预测,并对获得的分泌蛋白及所携带的信号肽进行系统分析。结果树鼩全基因组蛋白基因中鉴定获得279个分泌蛋白,占基因组全部编码基因的7.2%。对其功能和结构域进行注释分析,发现了以水解酶类、行使蛋白结合与离子结合功能蛋白质及初级代谢过程相关蛋白为主的分泌蛋白。氨基酸组成分析表明,树鼩分泌蛋白及其信号肽主要由疏水性氨基酸组成,信号肽剪切位点有部分亲水性氨基酸的存在。基序分析发现,分泌蛋白信号肽中未存在保守基序,而分泌蛋白内部存在GxHxCGG[FSV]L[IV][RAS][EP]D[WF]VLTAAHC、[KG]PPGV[YF]T[RK][VI][SC]x[YF][VL][DS]WIQx[TV][MI][RK]、[DT][SA][CF][QK]GDSGGPLVCNGV[LA]QG[IL]V、GY[HL][FL]CGG[SAT]L[ILV]S[EDP][CR]WV[LV][TS]AAHCF、N[IV][FI]FSP[LV]S[IV][SA][TA]ALAMLSLG[AT]xNDTLTQ[IL]L[EQ][GV]LGF[ND]LT[ES]T[SP]E 5种基序。结论在全基因组范围对树鼩分泌蛋白进行预测分析,有助于进一步研究树鼩机体功能调控机制及动物模型的开发。

神经营养因子Neurturin在Vero细胞中的表达及其生物学活性研究

目的探讨Neurturin(NTN)基因转染Vero细胞后的表达情况,为恒河猴帕金森病(PD)基因治疗打下基础。方法将表达载体pcDNA3-hNTN转染Vero细胞,挑选稳定表达克隆,用RT-PCR及免疫荧光分析鉴定,并对表达的人NTN蛋白进行了体外生物学活性测定。结果pcDNA3-hNTN质粒转染Vero细胞后获得了稳定表达克隆且有目的蛋白hNTN表达,表达的hNTN在体外能够促进培养的鸡胚背根神经节长出神经突起,并能促进体外培养的胚胎中脑多巴胺能神经元的存活。结论获得了能稳定表达NTN蛋白的Vero细胞株,其表达的hNTN对体外培养的中脑多巴胺能神经元具有保护作用,为移植并进行PD猴基因治疗动物实验打下了基础。

慢性胃肠黏膜损伤树鼩模型建立的探索

目的探索建立树鼩慢性胃肠黏膜损伤动物模型的可行性。方法将12只成年雄性树鼩随机分成3组,实验1、2组分别按2 mg/(kg·d)、1 mg/(kg·d)的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)的剂量,对照组予同等体积的生理盐水,连续腹腔注射实验树鼩56 d,观察树鼩体重变化,检测脑脊液多巴胺含量,观察镜下胃肠形态和组织病理改变情况。结果模型组体重和脑脊液多巴胺含量明显下降,胃窦、胃体、十二指肠均有不同程度的病理变化,但2 mg/kg、1 mg/kg剂量组之间无明显区别,对照组未见明显改变。结论采用长期,小剂量腹腔注射MPTP方式,是一种可行的慢性胃肠黏膜损害树鼩模型的造模方法,最理想注射剂量为2 mg/(kg·d)。

帕金森病不同疾病阶段的药物治疗进展

帕金森病(PD)分为前驱期、早期(稳定期)、中晚期(不稳定期)、晚期4个阶段。目前,针对PD运动症状的治疗药物包括多巴胺类药物、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶B抑制剂、儿茶酚胺-O-甲基转移酶抑制剂、抗胆碱药物等;而非运动症状的治疗主要为对症治疗。由于PD在不同的疾病阶段其症状不一致,治疗的目标和侧重点也应有差异。因此,该文针对PD不同疾病阶段的药物治疗进行综述。

基于α-突触核蛋白原纤维的帕金森氏疾病模型的研究进展

帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的神经系统退行性疾病,主要病理学标志为中脑黑质致密部可见部分的一种球状包涵体,称为路易小体(Lewy bodies,LBs)。LBs的主要成分为部分中空的放射状淀粉样纤维,而该淀粉样纤维的主要成分为α-突触核蛋白(α-synuclein,AS)。AS与PD的发生有着密切的关系,是PD致病机制研究中的关键蛋白。AS的原纤维具有独特的传播特性,且能诱发产生与PD病理相类似的一系列特征,因此其可以作为建立PD模型的全新材料。本文就基于AS原纤维的PD模型的研究进展进行综述。

非人灵长类帕金森模型的研究进展

帕金森病(Parkinson’s disease,PD),作为全球第二大神经系统退行性疾病,目前已有的治疗手段仍不能从根本上逆转疾病的进程,而治疗手段的发现和评价离不开动物模型的建立,一个可靠、有效的动物模型将有利于PD的发病机制、诊断、治疗方法以及药物筛选的研究。啮齿类动物和非脊椎动物已被广泛用于建立PD模型,但其并不能完全呈现人类PD的行为学和病理特征,而非人灵长类(nonhuman primate,NHP)在生理、解剖结构和免疫等方面与人最为接近,更适合用来探索疾病机理和发现新的治疗方式,因此,本文就帕金森病NHP模型的建立方法进行综述,为帕金森病NHP模型建立提供参考。

α-突触核蛋白的核易位机制及其功能

α-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-Syn)是一种脑内含量丰富的可溶性蛋白质,既能参与正常突触功能的维持和囊泡运输,又与多种神经退行性疾病有关,然而其确切的功能目前仍未完全清楚。已有研究表明,在生理条件下,α-突触核蛋白主要定位在细胞质中,少部分能定位在细胞核中,具有多种生物学功能。在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)患者大脑及氧化应激的细胞中,均发现α-突触核蛋白趋向于向细胞核中聚集。α-突触核蛋白核易位受到多种因素的精密调控,除自身氨基酸序列外,还受到其129位丝氨酸磷酸化(S129)水平、点突变(A53T,A30P,G51D)、细胞内Ca2+水平的影响,以及核输入蛋α(importin-α)、三结构域蛋白28(tripartite motif-containing protein 28,TRIM28)等多种蛋白质的精密调控,其异常的核易位则与细胞毒性相关。核易位的α-突触核蛋白能和组蛋白去乙酰化酶及组蛋白甲基化酶相互作用,从而改变组蛋白乙酰化和甲基化水平,最终影响染色质的稳定性。此外,α-突触核蛋白能与DNA相互作用,从而改变DNA构象、参与DNA损伤修复及基因表达调控。本文综述了α-突触核蛋白的结构特征,生理及病理条件下的细胞核内定位现象,详细的核易位机制及其在胞核中的功能研究进展,将有助于了解α-突触核蛋白生理功能及其在疾病发生发展中的作用。

过表达E46K突变α-synuclein通过JNK1-Bcl-2信号途径损害自噬功能

帕金森氏病（Parkinson’sdisease,PD）是一种以中脑多巴胺能神经元进行性丢失以及α突触核蛋白（αsynuclein）为主要成分的路易士小体（Lewybodies）的出现为特征的神经系统退行性疾病.遗传学研究表明,A30P,A53T以及E46K突变αsynuclein与家族性PD的发病密切相关,这就说明αsynuclein参与了PD的发病.然而α-synuclein的突变体是如何导致神经毒性的目前仍不清楚.越来越多的研究表明α-synuclein可以导致自噬溶酶体途径障碍.在本文中,过表达E46K突变α-synuclein能够损害哺乳动物细胞的大自噬.实验结果表明,过表达E46K突变α-synuclein后自噬的早期也就是自噬小体的形成发生障碍,该机制与JNK1-Bcl-2信号途径而不是mTOR相关.过表达E46K突变α-synuclein抑制了JNK1的活化,从而导致Bcl-2的磷酸化降低,进而增加Bcl-2和Beclin1的结合,进一步解聚Beclin1/hVps34的复合物,而此复合物是自噬起始的所必需的.本文的发现有利于阐明α-synuclein在PD发病中扮演的角色.

高效制备重组人α-突触核蛋白原纤维方法的建立

通过设计PCR引物,从pcDNA3.1-α-syn载体中扩增人α-突触核蛋白的编码DNA序列,将其克隆至PGEX-5X-1载体中,成功构建了人α-突触核蛋白高效原核表达载体pGEX-5X-1-syn。转化BL21菌株后进行IPTG诱导,通过对诱导剂浓度、诱导时间和温度、纯化方法和原纤维培养条件的优化,获取了重组人α-突触核蛋白原纤维,采用硫黄素T染色和透射电镜方法确认原纤维的制备情况。结果发现,经终浓度为1.0 mmol/L的IPTG,37℃条件下诱导3 h,人α-突触核蛋白得到大量表达。采用GST融合蛋白纯化磁珠进行蛋白纯化,可快速高效获取高纯度的人α-突触核蛋白,纯化产量可达到25 mg/L。浓度为9 mg/mL的人α-突触核蛋白,在37℃,1000 r/min震荡条件下培养至6 d,可大量成功制备人α-突触核蛋白原纤维,并在透射电镜下成功观察到了原纤维的形态。α-突触核蛋白原纤维是建立PD模型的重要材料,以上结果建立了一套可快速高效制备重组人α-突触核蛋白原纤维的方法,为PD的动物模型及细胞模型的建立提供了重要的研究材料。

新生乳鼠侧脑室注射rAAV2/9递送SNCA构建全脑转基因鼠

目的快速高效地构建一种人源SNCA(hSNCA)的全脑转基因鼠,并初步探究α-突触核蛋白过表达对小鼠中枢神经系统的影响。方法对新生乳鼠进行双侧侧脑室(intracerebroventricular,ICV)注射携带人源SNCA-EGFP或EGFP的重组腺相关病毒2/9(recombinant adeno-associated virus2/9,rAAV2/9)(1.5×10^(13) genome copies(GC)/mL),在2周和3个月龄用免疫荧光及Western blot检测α-突触核蛋白的表达模式及亚细胞定位,并用免疫荧光及免疫组化探究星形胶质细胞、小胶质细胞及病理性α-突触核蛋白的变化。结果用rAAV2/9侧脑室注射的方式成功构建了hSNCA全脑转基因鼠,α-突触核蛋白在整个脑中广泛表达,且趋向于在嗅球、皮层、海马、间脑及中脑中高表达。进一步研究发现,在嗅球、皮层、海马的CA2/3区及小脑的浦肯野细胞中观测到α-突触核蛋白在神经元胞核中表达的现象,α-突触核蛋白过表达引起了胶质增生。此外,在嗅球及大脑皮层检测到α-突触核蛋白Ser129磷酸化(pS129)及聚集。结论快速成功地构建了一种hSNCA全脑转基因小鼠模型,其α-突触核蛋白持久地高表达,并出现胶质增生和病理性α-突触核蛋白表达的现象,为研究α-突触核蛋白的生理功能及其在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)中的作用奠定一定的基础。

SOCS-3在肝脏疾病中的作用研究进展

细胞因子信号转导抑制蛋白-3(suppressor of cytokine signaling,SOCS-3)是一种细胞因子信号转导阻抑蛋白,参与体内多种信号转导通路的调节。研究发现,SOCS-3与肝纤维化、病毒性肝炎和肝肿瘤的发生发展均存在一定的关系,并且干扰素的抗病毒疗效与SOCS-3的遗传学表达改变密切相关。本综述将对SOCS-3的结构、分子功能及近年来在肝疾病中的相关研究进行简要总结。