针对不同形式猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组蛋白的抗体中和活性比较

GP5蛋白被认为是猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导中和抗体的主要蛋白,为探讨GP5蛋白诱导免疫保护的能力,本研究用杆状病毒/昆虫表达系统分别表达了全长和截短的GP5蛋白,同时用大肠杆菌表达系统表达了截短的GP5蛋白。三种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,以PRRSV全病毒作为ELISA包被抗原检测抗血清时,原核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1∶200,真核表达的全长GP5蛋白抗血清效价为1∶800,真核表达的截短GP5蛋白抗血清效价为1∶1 600。将获得的三种抗血清分别在猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)进行PRRSV同源(PRRSV VR2332)和异源(PRRSV HeN-3)毒株的血清学中和试验,并通过实时定量PCR方法检测各组中PRRSV mRNA的绝对拷贝数,以抗血清的病毒阻断率≥70%的最大血清稀释度作为该血清的中和效价。结果显示:1)三种重组蛋白的抗血清对两种PRRSV毒株的中和效价均<1∶2,不具有中和活性,部分稀释滴度的血清还增强了病毒的感染;2)抗PRRSV全病毒对照阳性血清对同源毒株的中和效价为1∶8,具有中和活性;对异源毒株的中和效价<1∶2,不具有中和活性,同时还产生了ADE增强作用。上述研究结果提示,GP5的主要中和表位可能更多是构象表位,PRRSV全病毒中主要诱导中和抗体产生的蛋白可能并不完全在GP5蛋白上;PRRSV全病毒阳性抗血清虽然能够提供一定的免疫保护,但这种免疫保护只发生在同源毒株之间,对异源毒株并没有效果,反而会介导ADE效应发生。

CD163分子胞外区功能结构域在PRRSV感染PAM细胞中的作用

目的研究猪CD163分子胞外区功能结构域在PRRSV感染PAM细胞中的作用。方法将实验室保存的PET-CD163-P1、PET-CD163-P2、PET-CD163-P3及PET-CD163-P4重组质粒转化到表达菌BL21(DE3)中,以最佳IPTG诱导表达的时间和最适诱导表达的浓度,大量诱导表达CD163-P1、CD163-P2、CD163-P3和CD163-P4重组蛋白,并用不同浓度的尿素洗涤纯化重组蛋白,然后用紫外分光光度计测定蛋白浓度。用不加血清的1640营养液将各重组蛋白稀释为2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/ml 5个不同的质量浓度,再分别与等体积的200个TCID_(50)/0.1 ml PRRSV病毒充分混匀后放置于37℃培养箱作用1 h,后用于感染PAM细胞,补加营养液作用48 h,同时设置单纯PRRSV感染对照组,用已建立的绝对荧光定量PCR方法检测感染细胞中PRRSV的拷贝数,并用Graph Pad Prism 5软件对所得到的数据进行处理。结果 CD163各片段不同稀释度的结构域重组蛋白与PRRSV混合作用感染48 h后,PRRSV的拷贝数均明显低于PRRSV单纯感染PAM细胞组的拷贝数,并且重组蛋白质量浓度越高,竞争结合抑制作用越明显。其中,CD163-P1片段各个质量浓度的结构域重组蛋白的竞争结合抑制作用相比其它片段更明显。结论 CD163各片段不同稀释度的结构域重组蛋白与PAM细胞上的CD163受体胞外区结构域在与PRRSV结合时存在竞争作用,该竞争结合使PRRSV的增殖明显降低,并且CD163-P1结构域片段可能在参与PRRSV感染PAM细胞中发挥主要作用。

PRRSV VR2332弱毒株经滴鼻、注射途径接种仔猪的病毒血症和抗体产生的差异分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR2332弱毒株经滴鼻和注射两种途径接种仔猪的病毒血症、抗PRRSV抗体以及抗PRRSV中和抗体的差异,选取20日龄健康仔猪9头,随机分3组,即滴鼻组、注射组和对照组。在感染后第0、3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43天前腔静脉采血,于第43天采血后摘取猪的脾、颌下淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结,并无菌收集猪肺泡巨噬细胞(PAM),通过实时荧光定量PCR方法检测病毒载量。用ELISA方法检测抗PRRSV抗体效价,用基于PAM的中和试验检测抗PRRSV中和抗体效价。结果显示:仔猪感染PRRSV后,①滴鼻组第3天只在2头猪血清中检测到PRRSV,第15-19天病毒血症达到高峰,病毒拷贝数均大于104拷贝·μL-1,第27天后病毒血症消失;注射组第3天从3头仔猪血清中均检测到病毒,在第15-23天病毒血症达到高峰,其中第19天病毒拷贝数大于105拷贝·μL-1,病毒血症从第31天后开始消失。②从几种淋巴结和PAM中均检测到PRRSV,且注射组的PRRSV拷贝数稍高于滴鼻组。③均在第27天从血清中检测到抗PRRSV抗体,随后抗体水平一直处于逐渐上升趋势,且第35-43天,注射组的抗PRRSV抗体水平高于滴鼻组。④滴鼻组在第35天之前抗PRRSV中和抗体效价都小于1∶2,第43天抗PRRSV中和抗体效价为1∶2;注射组在第3、11和19天的抗PRRSV中和抗体效价均小于1∶2,第27、35、43天的中和抗体效价分别为1∶4、1∶8、1∶4。试验结果表明,注射组的病毒拷贝数一直为滴鼻组的10～100倍,且病毒血症持续时间更长;注射组血清中抗PRRSV抗体产生的时间比滴鼻组早,并且抗体水平比滴鼻组高;滴鼻组抗PRRSV中和抗体水平很低,注射组产生的抗PRRSV中和抗体比滴鼻组早且抗体水平高。综上所述,VR2332弱毒株经注射免疫比滴鼻免疫能刺激猪产生更高水平的中和抗体,但同时也会引发更高水平的病毒血症。

不同包被抗原检测PRRS抗体间接ELISA方法的建立

为了建立更加敏感、特异、准确、有效地检测抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）抗体的间接ELISA方法，本研究利用RT—PCR方法分别扩增出PRRSVVR2332毒株的GP4和N蛋白完整编码基因，将2种基因片段分别和共同插入原核表达载体pET-32a中，成功构建重组质粒pET32a—GP4、pET-32a-N和pET-32a—GP4-N。将3种重组质粒分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达出GP4蛋白、N蛋白和GP4N融合蛋白，并对表达出的蛋白进行纯化。将3种已纯化的重组蛋白分别作为间接ELISA的包被抗原，通过不断优化反应条件，最终建立了检测抗PRRSV抗体的间接ELISA方法。分别使用该3种方法检测从河南省多个地区收集的200份猪血清样品中的抗PRRSV抗体，并与商品化试剂盒进行比较，结果显示，GP4蛋白做抗原时检测阳性符合率为82．7％，N蛋白做抗原时检测阳性符合率为87．2％，GP4-N融合蛋白做抗原时检测阳性符合率为85．5％；因此，N蛋白是间接ELISA方法检测抗PRRSV抗体的优势包被抗原。

感染PRRSV弱毒株后仔猪病毒血症和抗体产生规律

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1R弱毒株在仔猪体内的增殖及其诱导抗体产生的规律。本试验将PRRSV CH-1R弱毒株肌肉注射免疫9头45日龄健康仔猪,于免疫后0,7,14,28,35和42d通过前腔静脉采取新鲜血液,利用实时荧光定量PCR方法检测PRRSV在猪体内的增殖,ELISA方法检测抗PRRSV抗体,并利用基于PAM细胞建立的中和试验检测中和抗体。结果显示:PRRSV CH-1R弱毒株免疫仔猪后7d病毒在100%仔猪体内开始复制,免疫后7~14d时100%仔猪出现病毒血症,且病毒拷贝数达到最高,28~35d时56%仔猪病毒血症消失,42d时67%仔猪病毒血症消失;ELISA检测发现免疫后7~14d仔猪均未产生抗PRRSV抗体,28d时44%仔猪开始产生抗PRRSV抗体,42d时78%仔猪抗PRRSV抗体水平达到最高,有2头猪在0~42d一直未检测到抗PRRSV抗体;利用基于PAM细胞上建立的检测中和抗体的方法检测,免疫后7~14d均未产生中和抗体,28d时仅有22%仔猪产生低水平的中和抗体,35d时78%仔猪产生中和抗体,且在42d时其中和抗体水平达到最高。结果表明,PRRSV CH-1R弱毒株免疫仔猪后病毒血症在7~14d达到高峰,免疫接种后28~42d大部分仔猪病毒血症逐渐消失,即病毒增殖随时间呈递减趋势;抗PRRSV抗体及中和抗体均在免疫接种后28d开始出现且在42d抗体水平达到顶峰,即抗体水平随时间呈递增趋势。抗PRRSV的ELISA抗体与中和抗体水平呈正相关,而抗PRRSV中和抗体水平与病毒增殖呈负相关,但是有33%仔猪体内一直存在病毒,表明PRRSV CH-1R弱毒株免疫仔猪后,可诱导较低水平的抗体免疫保护反应,同时也可引起较低水平的病毒血症。

PRRSV GP5蛋白在杆状病毒表达系统中的表达

参照包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) VR2332株完整ORF5基因的载体pMD18T-ORF5的核酸序列设计引物,扩增全长的PRRSV ORF5基因片段,同时以SOE-PCR技术扩增缺失信号肽和跨膜区的ORF5核酸片段ORF5NC,分别克隆至Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBac-HTA,获得重组转移载体pFastBacHTA-ORF5及截短表达的重组转移载体pFastBacHTA-ORF5NC。将供体质粒分别转化DH10Bac细胞,获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,在Sf9细胞中分别成功表达了全长的GP5重组蛋白和缺失信号肽、跨膜区的截短GP5重组蛋白。2种重组蛋白经纯化后,免疫小鼠制备抗血清,ELISA方法检测免疫GP5全长和截短重组蛋白的小鼠血清中抗体滴度分别为1∶800和1∶1 600,表明重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验为进一步分析重组蛋白诱导中和抗体产生的能力以及为PRRSV基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。