池蝶蚌IκBα和c-Rel的结构特征及在LPS刺激下的表达分析

为研究淡水贝类NF-κB/Rel信号通路中核因子κB(Nuclear factor-κappaB,NF-κB)和NF-κB抑制因子(Inhibitors of NF-κB,IκB)的功能,对池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)IκBα和c-Rel(以下简称HsIκBα和Hsc-Rel)的序列结构、表达特征及Hs IκBα和Hsc-Rel之间的相互关系进行了分析。结果表明,Hs IκBα的c DNA全长为1783 bp,其开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)为1083 bp,编码360个氨基酸。Hsc-Rel的cDNA为2414 bp,ORF为2298 bp,编码765个氨基酸。通过构建HsIκBα-ORF-GST和Hsc-Rel-RHD-HIS重组质粒、原核诱导表达和纯化,进行GST-pull down,通过SDS-PAGE和Western Blot检测研究,发现HsIκBα和Hsc-Rel-RHD存在直接的相互作用。通过对池蝶蚌进行脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激后,分别在7个时间点(0、6h、12h、24h、36h、48h和72h)对10个组织中HsIκBα和Hsc-Rel的mRNA表达差异性进行分析,结果显示:HsIκBα和Hsc-Rel的mRNA在所有组织都有表达,且在肝胰腺组织表达最高,在血细胞表达最低。在6h时,HsIκBα在8个组织中和Hsc-Rel在7个组织中的表达水平都出现下调;在12h时,HsIκBα在10个组织中的表达量都上调,并且都达到了峰值。Hsc-Rel只有血细胞、心脏、肝胰腺和肠出现上调;在24h时,HsIκBα在10个组织中的表达值呈现下调,Hsc-Rel却都出现上调(肾组织除外),其中血细胞、斧足、肠的表达值达到峰值;在36—72h,HsIκBα和HscRel的部分组织的表达值逐渐恢复到基础水平,以上结果表明,HsIκBα和Hsc-Rel的表达量随着LPS的诱导而产生明显变化,说明其参与免疫应答反应,且可能存在应答LPS的NF-κB通路。

池蝶蚌HsPif基因的克隆及表达分析

为了探究池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)酸性基质蛋白Pif基因的基本功能,研究通过RACE-PCR技术首次在池蝶蚌中获得了Pif基因的cDNA全长序列,命名为HsPif,其全长为3457 bp, 5′端非翻译区(5′UTR)为485 bp,3′端非翻译区(3′UTR)为363 bp,开放阅读框(ORF)3072 bp,共编码1023个氨基酸,生物信息学分析结果显示HsPif蛋白含有一个von-Willebrand因子A型结构域和三个几丁质结合结构域;氨基酸组成成分结果表明天冬氨酸含量最高,组氨酸含量最低;HsPif蛋白亲水指数为–0.566,为亲水蛋白。构建系统进化树分析显示Pif基因保守性较高,与三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)Pif相似度最高,且与其他贝类在同一个大支上。组织荧光定量PCR结果表明:HsPif基因主要在外套膜中表达;分子原位杂交显示杂交反应主要在外套膜上皮细胞发生。进行植核手术后进行qPCR检测HsPif基因的表达量变化,实验结果表明, HsPif基因可能与珍珠层的分泌有关,有助于进一步了解珍珠形成的机制,为珍珠养殖提供参考。

温度对池蝶蚌雌雄同体和性逆转的影响

为探究温度对池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)性腺发育的影响,研究连续两年对池蝶蚌性腺进行雌雄同体现象筛选及跟踪观察,并采用5个温度诱导池蝶蚌生殖滤泡分化。通过对不同时期的池蝶蚌的性腺进行qRTPCR检测,同时利用原位杂交技术对性别决定关键基因Dmrt1进行细胞定位。结果显示:在自然条件下,6月龄池蝶蚌出现了雌雄同体现象,28月龄的雌雄同体蚌到30月龄左右会出现不同性别的分化(77.8%分化为雄蚌,16.7%维持雌雄同体现象,5.5%分化为雌蚌)。在不同温度刺激下,14月龄池蝶蚌出现了雌雄同体和性逆转现象。32℃刺激,14月龄雄蚌出现12.5%雌雄同体;27℃刺激,14月龄雄蚌和27月龄雄蚌分别出现37.5%和12.5%性逆转;23℃刺激,14月龄雌蚌出现14.29%性逆转;19℃刺激,14月龄雌蚌出现25%性逆转。qRT-PCR结果显示:Dmrt1在胚胎及6、27月龄表达显著高于其他时期,32℃刺激,在27月龄雄蚌中的表达显著高于其他温度,19℃刺激,在14、27月龄雌蚌中的表达显著高于其他温度;Fem1b、Fem1c的时空表达趋势基本一致,与Tra2a大体一致,在5、32月龄与Sox9相互抑制;19℃、23℃和27℃刺激,Fem1b、Tra2a和Sox9三个基因在14月龄雄蚌中表达显著高于其他温度,且23℃刺激,Sox9在27月龄雄蚌中表达也显著高于其他温度;Foxl2在27℃下的27月龄雌蚌中表达显著高于其他温度。Tra2a、Fem1b、Fem1c、Sox9和Dmrt1五个基因在不同月龄的雌雄同体蚌内表达有显著差异,Foxl2在雌蚌和雌雄同体蚌内表达显著高于同期雄蚌。原位杂交技术结果显示,Dmrt1 mRNA阳性信号主要定位在精原细胞、初级精母细胞和成熟卵母细胞中。综上所述,温度影响池蝶蚌生殖滤泡的分化,27℃及以上的高温容易诱导雄蚌向雌蚌逆转或产生雌雄同体现象,23℃及以下的低温容易诱导雌蚌向雄蚌逆转;并且温度很可能是通过调控Dmrt1等性别相关基因的表达量,从而调节生殖滤泡分化的。