KSHV抗凋亡蛋白vFLIP编码基因的克隆表达及抗vFLIP多克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备由卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)编码的病毒FLICE抑制蛋白(viral FLICE inhibitory protein,vFLIP)的多克隆抗体,通过vFLIP重组蛋白对该抗体特异性进行鉴定,并将此抗体初步应用于天然病毒vFLIP蛋白表达的检测。方法:对vFLIP蛋白抗原表位进行预测分析,设计并合成3条多肽,将合成肽与载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)偶联作为抗原,免疫新西兰白兔,制备抗vFLIP的多抗;以pCDH-vFLIP质粒为模板扩增vFLIP片段,插入到真核表达载体pEF-MCS-Flag-IRES/Puro中,构建pEF-vFLIP表达载体,利用脂质体将其转染HEK293T细胞,并在其中表达vFLIP。采用ELISA、蛋白质印迹法鉴定vFLIP多克隆抗体的效价及特异性,将该抗体用于天然病毒vFLIP的检测。结果:经限制性内切酶鉴定和核酸序列测定证实成功构建了重组质粒pEF-vFLIP,Flag抗体可以特异性识别该质粒在HEK293T和EA.hy926细胞内表达的vFLIP-flag融合蛋白。进一步的ELISA结果显示,制备的兔抗vFLIP多克隆抗体效价为1∶11 000以上。该抗体不但与HEK293T和EA.hy926细胞内表达的重组vFLIP-flag融合蛋白反应,而且能够特异性识别PEL细胞中天然的病毒vFLIP蛋白。结论:构建了含vFLIP基因的重组真核表达载体;采用人工合成肽作为半抗原制备的抗KSHV vFLIP多抗,可以成功地检测重组vFLIP蛋白和天然病毒蛋白。

运动训练大鼠组织芯片(TMAs)的构建与肌组织Hsp27和细胞凋亡的组织表达谱研究

目的:探讨运动训练大鼠TMAs的构建与细胞凋亡的组织表达谱特征。方法:采用跑台训练方式,建立大鼠有氧运动和疲劳运动模型,构建运动训练大鼠TMAs,应用免疫组织化学SABC法,观察大鼠骨骼肌、心脏和主动脉血管组织细胞凋亡及Hsp27蛋白组织表达谱变化。结果:制备了216点阵的运动训练大鼠TMAs,得到了不同运动强度对大鼠血管、心脏和骨骼肌组织细胞凋亡和Hsp27组织表达谱。其特征为Bax蛋白在心肌和骨骼肌中表达最多,血管平滑肌中表达较少,Bcl-2蛋白在心肌表达较多,在血管平滑肌及骨骼肌中表达较少,运动干预可显著影响Bcl-2/Bax比值在这3种组织中的变化。Hsp27蛋白在血管平滑肌中表达较多而在其他组织中表达较少,随着运动强度的增加,Hsp27蛋白表达基本呈上升趋势。结论:应用运动训练大鼠TMAs研究不同组织细胞凋亡和Hsp27的组织表达谱变化规律是可行的,值得推广。有氧训练可抑制大鼠血管、心脏和骨骼肌组织的细胞凋亡,疲劳训练可促进大鼠血管、心脏和骨骼肌组织细胞凋亡的发生,Hsp27蛋白参与了上述过程。

分泌性HIV-1 Nef-EGFP融合蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建含有人类免疫缺陷病毒I型(human immunodeficiency virus type Ⅰ,HIV-1)负性调节因子(nega-tive regulation factor,Nef)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的重组融合蛋白分泌性表达载体,并检测该融合蛋白在真核细胞中的表达及其在培养上清中分泌情况,为进一步研究Nef功能奠定基础。方法:利用PCR扩增出HIV-1 Nef和EGFP基因,插入到分泌性表达载体pSecTag2B中。构建的pSecTag2B-Nef-EGFP融合蛋白表达质粒,转染293T细胞,荧光显微镜下观测细胞中Nef-EGFP融合蛋白的表达。收集细胞及上清液,蛋白质印迹和ELISA法分别检测Nef-EGFP融合蛋白的表达及其分泌。结果:限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列测定证实,成功构建了含有Nef-EGFP基因的分泌性表达载体,该质粒转染293T细胞后,蛋白质印迹法能够检测到Nef-EGFP融合蛋白的表达条带,ELISA法检测上清液中目的蛋白分泌量为1.7 ng/ml。结论:成功构建含有Nef-EGFP的融合蛋白表达质粒,融合蛋白Nef-EGFP在293T细胞中获得表达,并能分泌到胞外。