蓝舌病新疆分离株VP7蛋白编码基因序列分析及一步法RT-PCR方法的建立

【目的】分析蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,建立蓝舌病新疆分离株一步法RT-PCR方法,为新疆BTV分子流行病学调查及防控提供技术支持。【方法】采用二代测序技术获得新疆分离株S7基因序列,登陆GenBank对序列进行同源性Blast比对,用软件MEGA 5.0分析序列差异,根据蓝舌病新疆分离株编码VP7蛋白S7基因保守序列,运用软件Oligo6.0设计引物,对蓝舌病新疆分离株S7基因进行RT-PCR扩增,并验证该方法的特异性及敏感性。【结果】蓝舌病中国新疆分离株编码VP7蛋白S7基因序列与哈尔滨报道BTV分离株S7基因片段相似度较高为89.64%,与中国云南报道BTV-29型分离株、蒙古国BTV分离株S7基因片段相似度分别为87.49%和87.39%;与德国BTV分离株S7基因片段相似度为80.70%,其余均无同源性序列。中国新疆分离株S7基因片段序列与4条同源序列间存在26处核苷酸差异,9处氨基酸差异。【结论】建立的蓝舌病中国新疆分离株S7基因片段一步法RT-PCR方法具有良好的特异性,仅BTV中国新疆分离株扩增获得目的条带,该方法的敏感性为4.0×10^(3)copies/mL。

高敏荧光层析法在骆驼布鲁氏菌病流行病学调查中的应用

目的了解新疆部分地区骆驼布鲁氏菌病(简称布病)流行情况,探索高敏荧光层析法在骆驼布病流行病学调查中的应用。方法分别在新疆阿勒泰地区、塔城地区、和田地区、伊犁地区、博尔塔拉蒙古自治州采集骆驼血清2000份,骆驼乳307份。应用布病虎红平板凝集试验(RBT)和试管凝集试验(SAT)进行骆驼布病血清学调查。提取骆驼乳基因组DNA,应用实时荧光PCR(Realtime-PCR)和AMOS-PCR方法进行病原学检测并分型。同时应用高敏荧光层析法对200份骆驼血清和100份骆驼乳样进行布病符合率检测。结果新疆5个地区骆驼血清SAT确诊阳性31份,布病血清学阳性率为1.55%(31/2000)。307份骆驼乳经Realtime-PCR检测,5份骆驼乳出现扩增曲线且Ct值在29.65~33.68,骆驼乳布鲁氏菌核酸阳性率为1.63%(5/307)。其中2份骆驼乳提取基因组DNA经AMOS-PCR扩增获得498 bp目的条带,测序并在NCBI进行BLAST比对分析,结果与牛种生物I型布鲁氏菌序列同源性在99.8%~100%。高敏荧光层析法检出骆驼布病阳性血清33份,阴性血清167份,该方法敏感性为96.77%,特异性为98.22%,与SAT检测方法总体符合率为98%,两种方法的Kappa值为0.925。高敏荧光层析法对100份骆驼乳检出布病抗体阳性乳7份,阴性乳93份,该方法与病原学检测方法(Realtime-PCR)总体符合率为98%。结论布鲁氏菌高敏荧光层析法具有灵敏度和特异度高的优点,且与布病常规检测方法符合率较好,可用于骆驼布病现场快速检测。骆驼布病流行病学调查数据提示应加强骆驼布病防控,同时加强骆驼乳的食品安全监管。

布鲁氏菌病M5、S2疫苗免疫血清半抗原-琼脂扩散试验方法检测评价

目的应用NH-AGID方法对布鲁氏菌M5、S2疫苗株免疫血清进行检测,评价该方法适用性。方法选取3~5月龄羔羊74只,随机分为3组。分别以S2株1.0×1010 CFU、5.0×109 CFU灌服和皮下注射接种羔羊各25只,M5株以1.0×10^(9) CFU皮下注射接种羔羊24只。免疫后7 d~150 d采集羊全血,分离血清,经RBT初筛和SAT确诊免疫抗体阳性血清。评估NH-AGID方法对M5和S2株疫苗免疫抗体与感染抗体的鉴别诊断特异性。结果NH-AGID方法对M5株疫苗免疫阳性血清的LPS抗体检出率为100%,NH抗体检出率8.3%~29.2%,鉴别诊断特异性为82.8%。对S2株疫苗口服组免疫阳性血清的LPS抗体检出率为31.2%~66.7%,NH抗体检出率为0%;皮下注射组免疫阳性血清的LPS抗体检出率为45.4%~100%,NH抗体检出率为4.5%~20%。对S2株疫苗免疫血清的鉴别诊断特异性为96.5%。结论NH-AGID方法不完全适用于羊用布鲁氏菌疫苗M5株和S2株的鉴别诊断,该方法的鉴别诊断特异性与疫苗毒力、免疫剂量和途径等因素相关,应进一步研究明确该方法的适用范围及条件,以期合理应用于布病防控诊断工作中。

布鲁氏菌A19-△VirB12疫苗接种犊牛的免疫抗体变化

为了解不同剂量的布鲁氏菌A19-△VirB12疫苗采用不同接种方式免疫犊牛的抗体变化,使用不同剂量的布鲁氏菌A19-△VirB12疫苗采用点眼和皮下接种两种方式免疫3~6月龄母犊牛,用试管凝集试验(SAT)检测采集于犊牛免疫各时段的血清中抗体变化。结果表明,首次试验中在免疫24周除点眼10亿组和皮下接种50亿组外的其他免疫组均能检出SAT阳性结果。第二次试验中皮下免疫50亿组在免疫3周的SAT检测阳性率达到84.21%,在免疫25周之后的SAT检测均为阴性;两个点眼免疫组在免疫12周初次检出持续抗体阳性,至免疫52周抗体阳性率为4.54%~9.09%。可以得出,布鲁氏菌A19-△VirB12疫苗大剂量免疫犊牛后可能会干扰后期布病检疫结果的判定,A19-△VirB12疫苗50亿CFU/mL皮下免疫犊牛后具有免疫原性较好和抗体转阴时间较早的优势。点眼免疫组检出抗体时间晚,现缺乏针对前期该疫苗细胞免疫指标的检测方法,需要进一步研究。

一起放牧羊群布鲁氏菌病的分析检测

【目的】研究一起放牧羊群布鲁氏菌病(布病)分析检测方法适用性,为防治措施提供依据。【方法】采用RBT、GICA、SAT、MAT、FPA、iELISA、cELISA和PCR等方法检测90份来自流产羊群的血清样品,并从诊断方法的适用性特点、现场调查的结果进行统计分析。【结果】在90份羊血清样品中,RBT、GICA、SAT、MAT、FPA、iELISA、cELISA的阳性检出率分别为:8.89%(8/90)、12.22%(11/90)、17.78%(16/90)、14.44%(13/90)、21.11%(19/90)、25.56%(23/90)、24.44%(22/90),PCR检测出14份阳性。【结论】初筛可选用RBT、GICA、FPA或iELISA等方法,确诊选用SAT、MAT或cELISA等方法。放牧羊群布病阳性率随年龄增加呈上升趋势(成年羊42%>断奶羔羊2.5%);雌性羊布病阳性率高于雄性(雌性29.68%>雄性11.54%),有流产史的羊群患布病的风险更高,成年雌性羊更易感染布鲁氏菌。检出阳性羊进行无害化处理,羊舍和周围环境进行彻底消毒,使用布病M5-90弱毒疫苗对阴性羊进行免疫,免疫2个月后允许交易和屠宰。

谷氨酰胺对严重烧伤后肠黏膜和机体免疫功能保护作用的临床观察

目的探讨谷氨酰胺对严重烧伤患者肠黏膜屏障作用的影响。方法将入选的严重烧伤病例分为对照组和治疗组,治疗组伤后应用谷氨酰胺颗粒10 g口服,3次/d,对照组接受安慰剂。于烧伤后第1、3、7、14天检测各组患者外周血二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸、血清IgG、Ig M、CD4+/CD8+及转铁蛋白。结果与对照组相比,治疗组烧伤后外周血DAO和D-乳酸水平无明显增高,在第7、14天均显著低于对照组;烧伤后第14天血清IgG、Ig M、CD4+和CD4+/CD8+均显著高于对照组;烧伤后第7、14天转铁蛋白水平亦高于对照组。结论应用谷氨酰胺能够对严重烧伤后肠黏膜屏障起到保护作用,同时也能在一定程度上促进患者免疫功能和营养状态的改善。

多种糖混合物的太赫兹时域光谱定性及定量分析研究

利用太赫兹时域光谱(terahertz time-domain spectroscopy,THz-TDS)技术研究了D-(-)-核糖、D-葡萄糖、α-乳糖一水合物及β-乳糖在0.3～1.6THz波段的光谱特性。结果显示THz波对几种糖结构的变化有灵敏响应,在测量波段内有各自特征的THz指纹吸收光谱。利用线性回归技术对含两至四组分混合体系的THz光谱进行定性及定量解析,获得了混合物中各组分含量,相对误差小于7.2%,并就误差产生的原因做了简要分析。实验结果表明THz-TDS技术能够用于材料的定性及定量分析研究,在生物医药的无损检测和质量控制等方面有重要的应用前景。

THz时域光谱在蛋白质研究中的应用进展

太赫兹时域光谱(THz-TDS)是基于飞秒超快激光技术的远红外波段光谱测量新技术,近年来在生命科学、医学制药、安全检测等不同研究领域中的应用进展迅速。文章结合THz-TDS技术的特点及其在生物分子光谱学研究中的物理基础,介绍了近年来利用THz-TDS技术研究氨基酸、肽和蛋白质的结构、构象、动力学及无标记检测等方面取得的成果和最新进展;总结了不同实验条件下测定的不同氨基酸、同种氨基酸异构体及肽在THz波段的吸收系数和折射率,并对不同实验室测定的结果进行了比较;阐述了THz-TDS技术研究干的、含水的蛋白质粉末以及蛋白质溶液的构象及动力学;介绍了THz-TDS技术在生物素-抗生物素蛋白无标记生物传感中的应用,并初步探讨了该技术在生物分子领域应用中有待解决的问题及发展前景。

布鲁氏菌分离株MLVA分子分型鉴定

目的对牛奶、羊奶以及羊流产胎儿中分离布鲁氏菌进行分型鉴定。方法采集新疆4个地区牛奶20份,羊奶20份,羊流产胎儿10份,分离培养后,运用VirB8-PCR和布鲁氏菌分子分型PCR(AMOS-PCR)方法对分离株进行布鲁氏菌属、种的鉴定,同时采用MLVA方法对分离株进一步鉴定,并将测定结果与http://mlva.u-psud.fr/数据库提供的布鲁氏菌数据进行比较,结合软件BioNumerics 6.6进行聚类分析。结果 6株分离株均为羊种3型布鲁氏菌,与辽宁省分离羊种3型布鲁氏菌在聚类分析中关系较近。结论 MLVA作为布鲁氏菌基因分型鉴定的一种快速、可靠的方法,为今后布鲁氏菌传染源的追溯及防控措施的制定提供依据。

羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株VirB12基因缺失株的构建及鉴定

为获得毒力较弱且能够区分疫苗免疫与自然感染的羊种布鲁氏菌候选疫苗株,本研究构建羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株VirB12基因缺失突变株。分别扩增Rev.1疫苗株VirB12基因上下游同源臂序列以及卡那霉素抗性基因,采用融合PCR方法将3个基因片段连接构建突变盒,连接至pMD19-T载体,电转化入布鲁氏菌Rev.1感受态细胞筛选阳性克隆,获得Rev.1-ΔVirB12突变株。Rev.1-ΔVirB12连续传代15代未发生回复突变。羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1-ΔVirB12的构建为羊种布鲁氏菌疫苗研制奠定了基础。

牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗双重实时荧光定量PCR方法的建立

目的建立一种区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒感染株的双重荧光定量PCR方法。方法分别以布鲁氏菌4型分泌系统中VirB8基因、VirB12基因序列设计2对引物及探针,优化实时荧光PCR反应体系及条件。以牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株、牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株、大肠杆菌、沙门氏菌基因组DNA进行Realtime-PCR扩增,评价该方法特异性。分别构建布鲁氏菌VirB12基因和VirB8基因片段阳性质粒,10倍系列稀释后进行Realtime-PCR扩增,测定该方法的敏感性。结果本方法具有良好的特异性,牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组DNA同时出现VirB8基因与VirB12基因阳性扩增,牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株仅出现VirB8基因阳性扩增,大肠杆菌、沙门氏菌均未扩增出目的条带,对VirB8基因及VirB12基因片段阳性质粒的检测限分别为约10^(2) copies/μL和10^(3) copies/μL。该方法仅用于鉴别区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒株。结论本研究建立的布鲁氏菌双重Realtime-PCR方法,具有良好的特异性和敏感性,为今后鉴别牛种布鲁氏菌A19-△VirB12分子标记疫苗免疫牛与自然感染牛提供技术支撑。

静脉移植5-BrdU标记骨髓间充质干细胞参与创面愈合的作用研究

目的:探讨经尾静脉移植入体内的骨髓间充质干细胞(BMSCs)参与皮肤创面愈合的情况。方法:以SD大鼠为研究对象,分离、培养并鉴定大鼠BMSCs。制作大鼠全层皮肤缺损动物模型;经尾静脉注入经5-BrdU标记的骨髓间充质干细胞,于不同时间点(3、7、14、21、28天)观察移植细胞参与创面愈合的情况。结果:经流式细胞仪鉴定细胞表达CD29、CD90表达阳性;CD45表达呈阴性;经体外标记的5-溴脱氧尿嘧啶标记率>90%;标记后的干细胞进行移植4周后,实验组大鼠创面局部及边缘可见BrdU标记的阳性细胞聚集,对照组中未发现明显的聚集现象。结论:5-BrdU完全能够满足移植细胞的标记需要。经尾静脉注射移植入体内的BMSCs可能参与皮肤创面愈合。

新疆畜间布病分子流行病学特征分析

【目的】新疆畜间布病流行株的流行病学特征,为新疆制定布病综合性防控措施提供科学依据和技术支撑。【方法】应用AMOS-PCR和MLVA-16方法对新疆畜间30株布鲁菌进行分析鉴定,将测定结果与http://mlva.u-psud.fr数据库提供的国内布鲁菌分离株的数据进行比较,结合软件Bionumerics进行聚类分析。【结果】30株布鲁菌中4株为牛种布鲁菌,26株为羊种布鲁菌。MLVA-16聚类分析结果表明,新疆地区30株布鲁菌可被分为10大基因群(A^J群)22个基因型,新疆地区流行的布鲁菌存在丰富的基因多态性。【结论】MLVA方法可对布鲁菌生物型和株间差异有很高的鉴别力,为布病疫情传染源的追踪和流行株的溯源进化关系提供科学依据。

新疆3个不同品种牛SLC11A1基因启动子克隆及序列分析

【目的】溶质性载体蛋白家族成员l(SLC11A1)基因是一个主要的自然抗性候选基因,与多种胞内寄生病原菌的抵抗作用相关,研究克隆新疆褐牛、荷斯坦牛和西门塔尔牛SLC11A1基因启动子序列,分析启动子序列差异,为奶牛抗病育种提供辅助选择的分子标记。【方法】分别采集新疆3个品种牛全血,提取基因组DNA,PCR扩增5ˊ端启动子区,测序。利用生物信息学软件Cp Gplot、Repeat Masker、TFSEARCH、WWW Signal Scan及双荧光素酶检测系统对获得序列进行分析。【结果】获得SLC11A1基因启动子片段1 463 bp,且具有启动子活性,未发现Cp G岛的存在。新疆3个品种牛间SLC11A1基因启动子序列未出现差异,但与美国安格斯牛SLC11A1基因启动子序列存在4处差异。启动子区预测到SP1,NF1,Rel A-p65,GKLF,CPBP等12个转录因子结合位点,并发现1个增强子区域(-734^-740),该序列存在两处短散的重复元件BOV-t A2、MIR3,以及重复DNA元件Charlie8。【结论】得到新疆地区3个品种牛SLC11A1基因启动子序列,并与安格斯牛SLC11A1基因启动子序列存在差异,为进一步研究SLC11A1基因多态性影响机体对胞内感染菌的抗性研究提供理论依据。

大鼠骨髓间充质干细胞在创面愈合中的作用

背景:骨髓可能是体内所谓间质组织的干细胞库,一旦组织受损,信号可通过未知方式到达骨髓,促进体内的间充质干细胞向创伤部位迁移。目的:探讨骨髓间充质干细胞在创面愈合中的作用。设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2006-07/2007-07在东南大学完成。材料:健康6～8周龄SD大鼠34只,由东南大学医学院实验动物中心提供。方法:取4只大鼠,采用全骨髓法体外分离培养骨髓间充质干细胞,取传至第5代细胞,移植前48h行BrdU标记。剩余30只大鼠麻醉后制作全层皮肤缺损模型,以对侧对称部位皮肤作为自身正常对照。造模后将标记的2×107个骨髓间充质干细胞经尾静脉注入体内。主要观察指标:于创伤后不同时间点采用大体观察、免疫荧光化学染色等手段,动态观察骨髓间充质干细胞参与创面修复情况。结果:大鼠造模后伤口有少量炎性渗出,细胞移植后7d创面均形成较硬的痂皮,14d创缘有新生表皮生成,21～28d大部分创面愈合,未出现炎症、化脓现象。细胞移植后第7,14,21,28天组织切片均可见BrdU染色阳性细胞,胞核呈绿色荧光,在创面边缘和创伤局部聚集。细胞移植后第14天组织切片可见BrdU染色阳性的细胞(胞核为绿色荧光)胞浆中有FⅧ表达,呈红色荧光,提示可能有部分骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞参与创面愈合。对侧正常皮肤未见明显的骨髓间充质干细胞聚集和增殖分化。结论:创伤可能是一种刺激因素,招募自身或外源的骨髓间充质干细胞参与创面愈合。

还原型及氧化型谷胱甘肽的太赫兹时域光谱研究

利用太赫兹时域光谱技术研究了还原型及氧化型谷胱甘肽在0.2-1.4THz波段的光谱特性,结果显示它们在测量波段表现出不同的吸收位置和吸收强度,同时折射率也表现出明显的差异,表明THz波对它们结构的变化有灵敏响应。研究提示太赫兹时域光谱技术作为一种新的光谱研究手段具有用于多肽及蛋白质等生物大分子结构与功能研究的潜力。

太赫兹辐射的研究及应用

太赫兹波(Terahertz。THz)是指频率在0.1~10 THz或波长为30μm^3 mm范围内的电磁波。THz频段是一个非常具有科学价值但尚未完全开发的电磁辐射区域,它在成像、医学诊断、环境科学、信息通信、生物化学及基础物理研究领域有着广阔的应用前景。本文综述了THz波的特点、发展状况,重点介绍了THz技术的应用领域,简单阐述了THz技术的发展方向及存在问题,并讨论了其发展前景。

牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗在阿勒泰地区推广应用

为了解牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗在阿勒泰地区牧业村免疫牛的安全性及免疫效果,分别在阿勒泰地区3个县选取6个牧业村,采用皮下注射方式5.0×1010 CFU免疫牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗,共免疫犊牛300头,在接种疫苗后第7 d,观察并记录免疫牛的健康状况,并采集免疫后15 d、20 d、30 d、90 d和180 d牛血清,按照国家标准规定布病虎红平板凝集和试管凝集试验,完成免疫抗体水平监测,对免疫后180d布病阳性血清,采用布病iELISA鉴别诊断方法,区分标记疫苗免疫抗体与布病自然感染抗体。对免疫后3 d、7 d以及15 d牛采集阴道拭子并提取基因组DNA,应用实时荧光PCR(Realtime-PCR)方法,开展布病病原学检测。免疫后7 d犊牛均未出现不良反应,免疫抗体在15d达到最高,阳性率为98.36%,随后逐渐下降,免疫后180 d抗体阳性率为21.67%,阳性血清经iELISA方法检测,结果均为标记疫苗免疫抗体。免疫后3 d、7 d以及15 d牛阴道拭子提取基因组DNA经Realtime-PCR检测均未检出布鲁氏菌阳性。牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗在阿勒泰地区不同县牧业村牛布病防控中安全、有效,同时具有鉴别诊断的优点,适用于牧业村推广应用,本研究为今后阿勒泰地区的布病防控提供了科学依据。

重组酶介导等温核酸扩增技术检测伯氏疏螺旋体方法的建立

本试验采用重组酶介导等温核酸扩增(RAA)技术建立伯氏疏螺旋体核酸的检测方法。根据伯氏疏螺旋体16S rRNA基因保守序列设计并合成特异性RAA引物,采用重组酶介导扩增技术电泳法,以10倍系列稀释1 ng/μL伯氏疏螺旋体B31基因组DNA为模板进行RAA,测定该方法的敏感性。通过对大肠杆菌、沙门菌、钩端螺旋体基因组DNA扩增验证该方法的特异性。结果显示,该方法对伯氏疏螺旋体标准株的B31基因组DNA检测限约为100 fg/μL,对大肠杆菌、沙门菌、钩端螺旋体均无扩增,具有良好的特异性。RAA具有特异性高、检测快速、灵敏等优点,本研究建立的伯氏疏螺旋体RAA检测方法,为伯氏疏螺旋体临床样本的快速诊断提供依据。

羊种布鲁氏菌疫苗株PCR-RFLP鉴定方法的建立

为建立一种羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株PCR-RFLP鉴定方法,利用羊种布鲁氏菌Rev.1具有链霉素抗性的特性,选取与链霉素抗性相关编码核糖体蛋白S12的rps L基因为模板设计引物,经PCR扩增后,将产物进行Nci I酶切,发现羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1出现约500 bp条带,而不具有链霉素抗性的羊种布鲁氏菌株16M则出现384 bp条带。结果表明,PCR-RFLP方法能够用于羊种布鲁氏菌Rev.1疫苗株的鉴定,这为今后区分羊种布鲁氏菌疫苗株Rev.1免疫与野株感染提供了基础。