神经营养素-4(NT-4)在昆虫杆状病毒表达系统中的克隆与表达

目的 通过昆虫杆状病毒表达系统的优势，表达出具有生物学活性的神经营养素-4（ hNT-4）蛋白。方法 通过 PCR方法获得 hNT-4成熟肽的基因，将其连接到昆虫表达载体 pAcGP67B上，在昆虫细胞 Sf9中进行表达。对表达产物进行免疫原性和生物学活性测定。结果 获得 hNT-4蛋白的表达产物， SDS-PAGE电泳显示表达产物相对分子质量为 15 000。 经 Western-blot验证，表达上清及细胞全蛋白均有一条能与抗人 NT-4抗体发生特异性免疫反应的条带。经 PC12细胞测定，表达上清中的 rNT-4蛋白具有明确的生物学活性。结论 hNT-4在昆虫杆状病毒表达系统中的表达为今后进一步深入研究 hNT-4的功能及其在临床中的应用提供了条件。

甲基营养型酵母系统表达的重组人表皮生长因子的纯化及其性质

目的 获得可用于动物试验和临床试验的人表皮生长因子原料药。方法 化学合成的人表皮生长因子基因在甲基营养型酵母中表达并分泌到培养基中的人表皮生长因子蛋白经 Phenysepharose 6 Fast Flow（ high sub）柱、 Q-sepharose High Performance柱、 Superdex 30柱纯化后进行生物学性质检测。结果 纯化后的蛋白产物纯度达 98％，是无热源、无内毒素、无甲基营养型酵母染色体 DNA污染的，有正确的分子量、等电点、氨基末端氨基酸顺序、肽图、紫外光谱、及生物活性性质的重组蛋白。结论 纯化蛋白符合动物试验和临床试验的要求，为制备多种人表皮生长因子制剂进行动物实验和临床试验打下了基础。

中缅输油管道瑞丽—禄丰段地质地貌特征及风险分析

中缅输油管道国内段的地貌类型为山地、丘陵、平原及山间沟谷,地形复杂、起伏剧烈;沿线跨越多条水系河流;输油管段所处的区域大地构造位置多为较不稳定的地段,个别处为不稳定地段,有些地段位于活动断裂带上,具备发生明显地表错位的地震地质构造条件;大部分工程地段地面土壤属强腐蚀性。调查分析认为,输油管道沿线未来有可能发生地震、山体滑坡、泥石流、地面沉陷、洪水冲击、土壤液化等自然灾害。新建管道开通后难以预测的自然灾害是不可忽视的风险因素。

包涵体中重组人神经生长因子的纯化、复性及鉴定

目的利用简单的纯化工艺，获得具有生物活性的重组人神经生长因子（rhNGF）。方法利用PET－11d－NGF／BL21工程菌表达rhNGF，通过改变培养基成份优化发酵条件。建立了一种在提取包涵体后经一步强阳离子柱层析的简单、快速、重复性好的rhNGF纯化方法。纯化产物用鸡胚背根神经节伸长法测定其生物学活性。结果优化发酵条件后，表达量提高至约占总菌体的10．9％。经一步层析，重组蛋白的纯度可达到80％以上。1BU（生物活性单位）约为0．5μg／mL。结论包涵体复性表明，包涵体的复性与复性液中氧化型与还原型含疏基化合物的比例密切相关。抑制杂菌生长，可明显提高rhNGF的表达量。纯化的rhNGF为分析NGF结构与功能及探讨其临床应用提供了材料。

故障树分析法在中缅长输原油管道失效风险评价的应用

长输原油管道失效最直接的原因是管道断裂和泄漏,腐蚀乃是引起管道断裂和泄漏的最主要风险因素。本文系统的分析了中国-缅甸长输原油管道发生断裂和泄漏的各个因素,采用故障树分析法,建立管道失效故障树,求出其最小割集,计算结构重要度,针对易发生失效的薄弱环节,制定了预防措施。

重组人EGF对培养的角膜缘上皮细胞增殖的影响

本实验采用重组人ＥＧＦ作用于体外培养原代生长的角膜织上皮细胞，观察重组人ＥＧＦ对细胞生长的影响，记录细胞生长曲线、集落形成率，并用ＭＴＴ法测定细胞增殖状况。结果表明：在合适的ＥＧＦ浓度作用下，细胞有丝分裂增强，细胞生长明显加快。在各浓度以１０ｎｇ／ｍＬ组对细胞作用最为明显。

胰岛素样生长因子结合蛋白-3与甲状腺激素受体α1的相互作用及其对甲状腺激素应答性基因转录的调节

目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)与甲状腺激素受体α1(TRα1)之间的相互作用,及其对甲状腺激素应答性基因转录作用的调节。方法采用谷胱甘肽-S-转移酶拉下实验、免疫共沉淀以及荧光共振能量转移实验检测IGFBP-3与TRα1之间的相互作用;激光共聚焦显微镜观察两种蛋白在细胞中的分布;采用双萤光素酶实验检测过表达IGFBP-3对甲状腺素T3激活的生长激素启动子的影响。结果谷胱甘肽-S-转移酶拉下实验、免疫共沉淀以及荧光共振能量转移实验结果证明IGFBP-3与TRα1在体内和体外都可以相互作用,激光共聚焦显微镜观察IGFBP-3和TRα1可以共定位于HEK-293细胞的细胞核。通过双萤光素酶实验检测到过表达IGFBP-3可以抑制甲状腺激素对生长激素启动子的激活作用(P<0.01)。结论 IGFBP-3通过与TRα1相互作用抑制甲状腺激素应答性基因的转录,为IG-FBP-3在核内发挥胰岛素样生长因子非依赖的作用提供了新的实验依据。

胰岛素样生长因子结合蛋白-6的核定位

目的研究胰岛素样生长因子结合蛋白-6(IGFBP-6)在细胞中的定位。方法用重叠PCR法构建IGFBP-6的核定位序列缺失体(pEGFP-C1-BP6ΔNLS)及突变体(pEGFP-C1-BP6-Mut)质粒,与野生型IGFBP-6质粒分别转染PC-3M细胞,激光扫描共聚焦显微镜观察绿色荧光融合蛋白在细胞中的分布,并计算这些转染阳性细胞中绿色荧光强度的核质比(Fn/c)。结果激光扫描共聚焦显微镜观察显示,野生型IGFBP-6绿色荧光信号在细胞核内聚集分布,与转染EGFP空载体的对照组相比,Fn/c差异具有显著性(P<0.05)。过表达pEGFP-C1-BP6ΔNLS的细胞中,绿色荧光信号在细胞核内聚集的现象消失,在整个细胞呈均匀分布;过表达pEGFP-C1-BP6-Mut的细胞中,细胞核内绿色荧光信号也有所减弱;两者的Fn/c与转染野生型IGFBP-6的细胞相比差异均具有显著性(P<0.05)。结论IGFBP-6可以定位于细胞核内,它在细胞核内的分布与其核定位序列相关,为进一步研究IGFBP-6不依赖于胰岛素样生长因子的生物学活性提供了新的实验依据。

靶向性抗肿瘤融合蛋白-表皮生长因子-腺病毒早期转录区4第4编码蛋白在细胞内的转运及对胞外信号调节激酶磷酸化的影响

目的探讨经表皮生长因子受体介导进入肿瘤细胞的融合蛋白表皮生长因子-腺病毒早期转录区4第4编码蛋白(EGF-E4orf4)在细胞内的转运及对胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化的影响。方法采用间接免疫荧光结合激光共聚焦显微镜观察融合蛋白在MDA-MB-231和BGC823细胞中的转运和代谢特点,Western blot检测融合蛋白引起的细胞内ERK磷酸化水平的改变。结果融合蛋白可在细胞内累积,向细胞核周围聚集,并与细胞早期内体和晚期溶酶体共定位;融合蛋白能快速触发细胞内ERK发生磷酸化,磷酸化水平在10 min时最强,之后逐渐回落至刺激前水平,活化ERK的能力较表皮生长因子弱。结论融合蛋白EGF-E4orf4在细胞内经内体-溶酶体途径发生缓慢降解;在MDA-MB-231和BGC823细胞中,融合蛋白的作用特点存在明显差异,可能是导致融合蛋白对二者抑瘤率不同的原因之一。

YAF2靶向cyclinD1表达促进肿瘤细胞增殖

目的研究YY1相关因子2(YAF2)在肿瘤细胞中上调细胞周期蛋白D1(cyclin D1)表达的分子机制以及对肿瘤细胞增殖的影响。方法在肿瘤细胞中过表达和敲低YAF2,用Western blot和实时荧光定量PCR实验检测YAF2和cyclin D1的表达;利用双荧光素酶报告基因实验探究YAF2对cyclin D1启动子活性的影响;流式细胞计量术分析YAF2对细胞周期的影响与cyclin D1表达的关系;平板克隆形成实验检测YAF2和cyclin D1不同表达水平对细胞增殖的影响。结果 YAF2上调cyclin D1的mRNA(P<0.05)和蛋白水平;YAF2激活cyclin D1的启动子(P<0.05);敲低YAF2通过调节cyclin D1使G_0/G_1期细胞比例增加(P<0.0001),S期细胞比例减少(P<0.002);YAF2通过靶向cyclin D1促进细胞克隆形成(P<0.05)。结论在肿瘤细胞中,YAF2激活cyclin D1表达,促进肿瘤细胞周期进展和增殖。

在毕赤酵母中表达的重组人血管内皮生长因子(rhVEGF_(121))为氨基端4个氨基酸缺失的异构体

为获得重组人血管内皮生长因子 ,采用重叠PCR扩增出含Kozak顺序、α因子前导肽和hVEGF12 1的融合基因 ,经DNA测序无误后 ,插入Pichiapastoris酵母载体 ,并体外构建 4拷贝表达单元质粒pAO81 5 4KαVEGF12 1。表达载体转化酵母宿主菌GS1 1 5 ,筛选出高效表达hVEGF的转化子。摇瓶培养并 1 %甲醇诱导 80h的VEGF分泌性表达量可达 30mg L。表达产物经S Sepharose离子交换层析纯化后测活表明表达产物二聚体具有良好生物活性。SDS PAGE分析、Western印迹表明表达产物具有适宜的分子量和抗原性。VEGF蛋白经氨基端氨基酸测序证实纯化后的不同糖化程度产物为同一蛋白质 ,但均为氨基端缺失了 4个氨基酸的全长为 1 1 7个氨基酸的VEGF。

HRSP12慢病毒表达载体的构建及对宫颈癌HeLa细胞凋亡及增殖的影响

目的构建热反应蛋白12(heat-responsive protein 12,HRSP12)慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,包装慢病毒颗粒并感染宫颈癌细胞HeLa,分析过表达的HRSP12对HeLa细胞凋亡和增殖的影响。方法用反转录PCR扩增HRSP12全长编码顺序,构建慢病毒表达载体,利用人胚肾细胞HEK293T包装重组的慢病毒颗粒,感染HeLa细胞,用蛋白免疫印迹法检测剪切的半胱氨酸/天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)并用MTS比色法检测HeLa细胞增殖的情况。结果编码全长HRSP12的cDNA片段为414bp,克隆至pWPI-linker载体成功构建了慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,包装的慢病毒颗粒能够高效感染HeLa细胞,在细胞内表达Flag-HRSP12融合蛋白。HRSP12的过表达能够引起HeLa细胞caspase-3的剪切体增多,能够抑制HeLa细胞的增殖。结论成功构建了慢病毒表达载体pWPI-HRSP12,初步结果表明,HRSP12可能具有诱导HeLa细胞凋亡、抑制细胞增殖的活性,为进一步研究HRSP12的生物学功能奠定了基础。

TrkA与snapin蛋白的直接相互作用

目的确认TrkA与snapin蛋白间的直接相互作用。方法采用DNA重组技术,构建增强型荧光蛋白表达载体pECFP-TrkAICD(TrkA膜内区)和pEYFP-snapin,共转染HEK 293T细胞后以激光扫描共聚焦显微镜观察并进行荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)分析。结果成功构建了snapin和TrkA的重组质粒,共转染细胞后激光扫描共聚焦显微镜分析表明两种蛋白分布在细胞质同一层面,荧光共振能量转移(FRET)分析表明能量转移效率>5%,与对照相比有显著区别(P<0.05)。结论激光扫描共聚焦及FRET实验结果都证明了TrkA膜内区与snapin两个蛋白之间存在着直接的相互作用。

利用CRISPR／Cas9技术敲除HeLa细胞中YAF2基因

目的利用CRISPR/Cas9技术建立YAF2(YY1 associated factor 2)基因敲除的宫颈癌He La细胞株,用于YAF2基因在宫颈癌细胞中分子功能的研究。方法首先利用CRISPR/Cas9序列设计网站,设计两对靶向YAF2基因第2外显子不同位点的向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,分别克隆至质粒p X335中,测序确认插入片段正确的克隆。先用一对重组载体转染He La细胞,7天后,再用另一对转染He La细胞,第2对转染3天后,取培养细胞的2/3提取基因组DNA,对敲除位点附近的片段进行PCR扩增后通过DNA测序对敲除效率进行分析,剩余细胞在96孔平板上通过有限稀释法筛选YAF2敲除的细胞株。用蛋白质免疫印迹实验初步鉴定YAF2蛋白质表达缺失的细胞克隆,提取其基因组DNA,对敲除位点附近的序列进行PCR扩增,将扩增产物克隆至p GEM-T easy载体,通过DNA测序确认YAF2基因纯合敲除的细胞株。结果成功构建两对针对人YAF2基因第二外显子的p X335-sgRNA质粒;PCR产物测序证明两对重组载体均有YAF2基因敲除活性;得到2株YAF2敲除的He La细胞株。结论利用CRISPR/Cas9技术在He La细胞中成功敲除YAF2基因,为在He La细胞中研究YAF2的分子功能奠定基础。

头孢克肟治疗轻中度社区获得性肺炎患儿疗效及安全性评价

社区获得性肺炎是指在医院外罹患的肺炎,好发于冬春季,儿童由于抵抗力较差,细菌容易突破机体的防御屏障进入体内,因而好发。其主要临床特点是出现咳嗽、发热、寒颤等症状,X线片显示肺部出现异常变化[1-2]。目前,对于轻中度的社区获得性肺炎,临床上常用的治疗方式是药物治疗,主要是应用抗生素治疗,常用药物为阿莫西林。

重组EpoAB-NGF模拟肽的神经营养功能

目的:研究重组融合蛋白红细胞生成素AB肽-神经生长因子模拟肽(EpoAB-NGF9和EpoAB-NGF/12)的神经营养作用。方法:构建pET-42a-EpoAB-NGF9/12原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,显微镜观察PC12细胞诱导分化,流式细胞仪检测凋亡细胞。结果:大肠杆菌表达的重组融合蛋白GST-EpoAB-NGF9/12分子量约为30kDa,抗GST抗体免疫印迹反应呈阳性。融合蛋白可以诱导PC12细胞分化,促进轴突生长。R2L1细胞去血清培养,凋亡细胞占(31.7±0.60)%,去血清后加入融合蛋白GST-EpoAB-NGF9/12,细胞凋亡率分别为(25.2±3.52)%、(25.7±1.46)%,呈现一定程度的抑制细胞凋亡的活性。结论:重组EpoAB-NGF模拟肽融合蛋白具有与NGF类似的神经营养作用。

基于VN210/VC210的双分子荧光互补定量分析cofilin-actin相互作用的特异性

目的:利用双分子荧光互补技术定量分析cofilin-actin的特异性相互作用。方法:首先构建表达VN210(编码荧光蛋白Venus 1-210氨基酸)和VC210(编码荧光蛋白Venus 210-238氨基酸)探针的质粒,通过梯度剂量转染检测该探针对的自组装能力;其次构建VN210/VC210与bJun、bFos、Fos△zip、cofilin(WT)、cofilin(S3E)和actin的融合表达载体,在HeLa细胞中分别过表达不同载体组合,以VN210-bJun/bFos-VC210组作为阳性对照,以VN210-bJun/bFos△zip-VC210组作为阴性对照,使用多功能细胞观测显微镜观察并拍摄荧光图像;最后使用多功能微孔板检测仪,对对照组进行波谱扫描,确定最适合检测的激发光波长和发射光波长,再以此选择波长检测实验组中可观察到荧光信号组合的荧光强度,进行统计分析。结果:(1)VN210/VC210在各转染剂量组中均未观察到荧光信号;(2)阳性对照组可观察到荧光信号,阴性对照组未观察到荧光信号;实验组中,VN210-cofilin(WT)/actin-VC210组荧光信号较强,VN210-cofilin(S3E)/actin-VC210和VN210/actin-VC210组荧光信号较弱,其余组均观察不到荧光信号;(3)产生荧光信号的实验组中,VN210-cofilin(S3E)/actin-VC210和VN210/actin-VC210组间的荧光信号无显著差异,但分别与VN210-cofilin(WT)/actin-VC210组具有显著差异。结论:VN210/VC210双分子荧光互补技术可定量检测cofilin-actin的特异性相互作用。