抗蓝耳病shRNA转基因表达载体的构建与功能验证

将靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的shRNA表达盒插入pEGFP-N1的EcoO109I酶切位点构建重组转基因载体pEGFP-G1,并在转基因Marc-145细胞验证其抑制PRRSV复制的功能。用pEGFP-G1转染Marc-145细胞24 h后感染欧洲型PRRSV,病毒感染后每天观察细胞病变(CPE)情况。试验结果表明:所获pEGFP-G1可明显抑制PRRSV复制。

NOD样受体家族蛋白3调控子宫内膜间质细胞催乳素分泌的作用机制

目的NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)在子宫内膜中的生理性功能研究较少。文中旨在研究NLRP3在子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中的表达和调控作用。方法选自2020年4月至6月在东部战区总医院生殖中心20例不孕症患者的子宫内膜样本。收集人增殖期(n=10)及蜕膜期(n=10)的子宫内膜。另选用SPF级30只6~8周龄雌鼠和10只雄鼠,获取小鼠交配后见栓天数(dpc)0.5~7.5天的子宫内膜,采用Western blot、免疫组化检测NLRP3的表达及定位。体外利用对羟基苯甲酸甲酯(MPA)和8-溴-环腺苷酸(8-Br-cAMP)联合诱导人间质细胞系T-HESCs蜕膜化,检测蜕膜化过程中NLRP3的表达情况。干扰NLRP3的表达后,通过实时荧光定量PCR及ELISA分别检测细胞及其培养上清中蜕膜化标志物催乳素(PRL)的表达情况。结果免疫组化结果显示,在人蜕膜期子宫内膜中,可见大量NLRP3阳性细胞,蜕膜期NLRP3的表达量较增殖期显著上升。Western blot结果所示,人蜕膜期子宫内膜较增殖期NLRP3显著高表达。免疫组化结果所示,NLRP3在小鼠妊娠早期上调,dpc 3.5天表达最高,可见大量NLRP3阳性细胞表达,细胞质棕黄色深染,之后下降。Western blot结果所示,在小鼠妊娠早期,随着妊娠时间增加,NLRP3表达量先上升后下降,dpc 3.5天达到峰值,与dpc 0.5天和dpc 7.5天比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。Western blot结果所示,随着诱导人间质细胞蜕膜化时间延长,NLRP3及caspase-1表达量显著升高。与12 h NLRP3、caspase-1蛋白表达量(1.76±0.04、1.28±0.02)比较,0 h(1.00±0.01、0.98±0.01)明显降低,24 h(2.26±0.03、1.95±0.05)明显升高(P<0.05)。结论NLRP3可促进间质细胞蜕膜化过程中PRL的表达和分泌,为研究NLRP3在子宫内膜围种植期调控间质细胞蜕膜化奠定基础。

无创胚胎染色体筛查在男性严重少弱畸精子症不育患者的临床应用

目的:探讨无创胚胎染色体筛查技术(NICS)对男性严重少弱畸精子症辅助生殖妊娠结局的应用价值。方法:随机选取2017年1月至2020年12月因男方严重少弱畸形精症行辅助生殖助孕的男性不育患者共计170例,接受NICS治疗的85对夫妻作为试验组,接受卵胞质内单精子注射(ICSI)85对夫妇作为对照组,比较两组女方年龄、女方体重质量指数(BMI)、抗苗勒氏管激素(AMH)、基础窦卵泡计数(AFC)、不孕年限、男方年龄、精子浓度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率、精子DNA碎片化指数(DFI)、获卵数、正常受精数、优质囊胚数、临床妊娠率、流产率的差异。结果:NICS组与ICSI组相比,女方年龄、女方BMI、AMH、AFC、不孕年限、男方年龄、精子浓度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率、精子DFI、获卵数、正常受精数、优质囊胚数均无统计学差异(P均>0.05),NICS组明确诊断率88.24%,检测胚胎染色体整倍体率48.56%,NICS组挑选整倍体胚胎移植后临床妊娠率高于ICSI组(66.28%vs 51.09%)、而流产率低于ICSI对照组(12.28%vs 29.79%),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:对于男性严重少弱畸形精子症不育患者,NICS技术可以提高临床妊娠率、降低流产风险。

短链脂肪酸对体外氧化应激诱导的卵母细胞成熟障碍的保护作用

目的短链脂肪酸(SCFAs)对卵母细胞体外成熟的作用及其可能的机制尚不明确。文中探讨短链脂肪酸对小鼠卵母细胞体外诱导氧化应激后发育成熟的影响及其作用机制。方法收集6~8周龄ICR雌鼠生发泡(GV)期的卵母细胞,分为对照组(不干预)、H_(2)O_(2)处理组(50μmol/L H_(2)O_(2)处理1.5 h)、H_(2)O_(2)+乙酸组(50μmol/L H_(2)O_(2)处理1.5 h后,1 mmol/L乙酸干预)、H_(2)O_(2)+丙酸组(50μmol/L H_(2)O_(2)处理1.5 h后,10μmol/L丙酸干预)和H_(2)O_(2)+丁酸组(50μmol/L H_(2)O_(2)处理1.5 h后,2μmol/L丁酸干预)。并于培养3 h后观察生发泡破裂(GVBD)率,于培养16 h后观察第一极体排出(PBE)率;免疫荧光化学染色法检测体外培养9 h进入第一次减数分裂中期(MI期)和16 h排出第一极体进入第二次减数分裂中期(MII期)的卵母细胞内染色体的排列和纺锤体的形态;Western blot检测不同处理组Pi3k/Akt通路相关蛋白表达量。结果成熟率结果显示,与对照组GVBD率[(86.87±1.76)%]和PBE率[(85.37±1.98)%]相比,H_(2)O_(2)处理组[(66.73±1.25)%、(50.57±4.22)%]明显下降(P<0.05),而与H_(2)O_(2)处理组相比,H_(2)O_(2)+乙酸组[(80.67±2.62)%、(78.07±1.78)%],H_(2)O_(2)+丙酸组[(74.50±2.91)%、68.03±1.84)%]和H_(2)O_(2)+丁酸组[(75.93±2.12)%、(66.40±3.46)%]卵母细胞的成熟率显著改善(P<0.01)。免疫荧光结果显示,在添加了SCFAs的M2培养液中成熟的卵母细胞减数分裂的超微结构较H_(2)O_(2)处理组明显改善,主要体现在染色体排列和纺锤体形态的改变。Western blot结果显示,H_(2)O_(2)处理组卵母细胞中的p-Akt和Akt蛋白表达量的比值较对照组明显增多(P<0.01),而H_(2)O_(2)+乙酸组和H_(2)O_(2)+丙酸组较H_(2)O_(2)处理组明显降低(P<0.01)。结论在体外培养液中添加短链脂肪酸可以改善氧化应激后小鼠卵母细胞的发育潜能,为改善体外氧化应激诱导的卵母细胞成熟障碍提供新思路。

抗猪繁殖与呼吸综合征病毒转基因细胞系的建立

采用脂质体法将具有抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的shRNA质粒pEGFP-N1-shRNA导入PK-15细胞中,经G418药物筛选后,分离扩增绿色荧光蛋白阳性细胞,获得抗PRRSV转基因PK细胞系。通过对转染方法和条件的优化,确立最佳的转染及筛选步骤;对得到的阳性转基因细胞进行冷冻-解冻,并作PCR检测。结果表明,G418最佳筛选浓度为600μg/mL,脂质体与质粒的最佳转染比例为7∶2,最佳转染时间为24 h。本研究成功建立抗PRRSV转基因细胞系,为进一步的功能验证及体细胞核移植奠定了基础。

鸦胆子苦醇调控小鼠雌性生殖细胞减数分裂启动及早期卵子发生

目的探讨鸦胆子苦醇对雌性生殖细胞减数分裂启动及早期卵子发生的影响。方法6~8周小鼠雌雄合笼,以雌性小鼠见阴栓记为胚胎0.5d(E0.5)。收集E11.5、E12.5、E13.5、E14.5的雌性胎鼠生殖嵴,分别通过qRT-PCR及Western blotting检测核因子E2(NF-E2)相关因子2(Nrf2)mRNA及蛋白水平。分离E12.5雌性胎鼠的生殖嵴,分别用二甲基亚砜(对照组)、10nmol/L、20nmol/L的Nrf2抑制剂——鸦胆子苦醇、1μmol/L视黄酸或20nmol/L鸦胆子苦醇+1μmol/L视黄酸处理48h后,检测Nrf2通路、减数分裂启动、视黄酸信号通路相关基因的mRNA水平。药物处理48h后继续培养10d,对体外培养的生殖嵴行石蜡切片和HE染色进行原始卵泡计数。结果与对照组相比,10nmol/L、20nmol/L的鸦胆子苦醇显著下调减数分裂启动关键基因Stra8、Sycp3及Dazl的mRNA水平(P<0.05)。与对照组的单位面积卵泡数量(151.1±6.8)相比,10nmol/L、20nmol/L组的单位面积原始卵泡数量显著减少(109.5±12.2,49.1±8.0)(P<0.01)。与对照组相比,20nmol/L鸦胆子苦醇显著抑制视黄酸合成酶(P=0.001)及其受体(P=0.049)的表达。添加视黄酸能部分挽救鸦胆子苦醇对基因Raldh、RARa(P<0.01)及基因Stra8、Sycp3及Dazl的表达抑制作用(P<0.01)。结论鸦胆子苦醇通过抑制Nrf2通路调控减数分裂启动及早期卵子发生。

调控卵巢功能的基础研究和临床应用

人口问题关乎社会稳定、经济发展、民族振兴.由于计划生育政策的长期实行,中国人口危机渐行渐近,带来的经济社会问题日益严峻.近年出生人口大幅减少,生育意愿大幅降低,人口老龄化加速到来.二孩、三孩政策全面实行不及预期,生育堆积效应已然消退.据世界卫生组织(WHO)报道,发展中国家每4对育龄夫妇就有1对面临生育障碍问题,根据WH0人类生殖特别规划署报告,世界范围内不孕不育率高达15%~20%,成为继癌症和心脑血管疾病外的第三大类疾病.