光化学栓塞法建立缺血性脑卒中动物模型

背景:实验性缺血性脑卒中动物模型是研究缺血性脑卒中病理机制以及研究开发新治疗方案必不可少的工具,光化学栓塞法制作缺血性脑卒中动物模型操作简便,稳定性好,重复性高,可有针对性的控制梗死灶的位置以及大小,是研究缺血性脑卒中病理机制的良好选择。目的:建立光化学栓塞法缺血性脑卒中动物模型,对比不同性别小鼠缺血性脑卒中后梗死体积以及行为学表现的异同。方法:62只昆明小鼠依据检测内容分为病理学检测6只、梗死体积测试16只和行为学测试40只。其中病理学检测小鼠分为假手术组和模型组,各3只;梗死体积测试小鼠分为雌性模型组和雄性模型组,各8只;行为学测试小鼠分为雌性模型组、雌性假手术组、雄性模型组和雄性假手术组,各10只。模型组(含雌性模型组和雄性模型组)小鼠采用光化学栓塞法制备局部缺血性卒中模型,假手术组(含雌性假手术组和雄性假手术组)小鼠不注射孟加拉玫瑰红染料。结果与结论:尼氏染色显示模型组小鼠梗死中心出现神经元变性坏死,空泡样病理改变,Fluoro-Jade C染色可见模型组小鼠梗死中心中出现变性神经元,且雌性小鼠脑梗死体积显著小于雄性小鼠,模型组小鼠行为运动功能受损程度显著大于假手术组小鼠,其中雌性小鼠运动功能受损程度小于雄性小鼠。表明光化学栓塞法可以成功建立缺血性脑卒中动物模型,且相同条件下缺血性脑卒中对于雄性造成的神经功能损伤更为严重。

新生小鼠海马、嗅球及皮质神经干细胞的分离培养及鉴定

背景:从体外分离培养出高纯度、生物学性能均一的神经干细胞,建立起一套完整的神经干细胞培养体系,是进行神经干细胞研究的基础。目的:建立新生小鼠海马、嗅球、皮质组织神经干细胞的分离培养体系,并对其生物学特性进行分析。方法:分离新生昆明小鼠海马、嗅球、皮质组织,采用机械分离和胰酶消化法提取原代神经干细胞。采用无血清培养技术、机械吹打和酶消化法进行传代培养神经干细胞。以体积分数为10%的胎牛血清诱导分化神经干细胞。对神经干细胞及其分化产物行CD133、巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色鉴定。结果与结论:从新生小鼠海马、嗅球、皮质可提取出具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞,经巢蛋白、CD133免疫荧光染色检测呈阳性;神经干细胞经胎牛血清诱导后可分化为β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞,并证实染色阳性细胞为神经元和星形胶质细胞。该实验建立了一套神经干细胞体外分离培养、纯化、鉴定、诱导分化方案,为后续神经干细胞研究的顺利进行奠定了实验基础。

神经干细胞体外培养鉴定及诱导分化的表型特征

背景:神经干细胞促进受损中枢神经系统结构和功能再修复具有广阔的应用前景,而进行神经干细胞体外培养鉴定及诱导分化表型的研究是实现这一应用的基础。目的:观察神经干细胞在体外培养条件下的生物学特性和分化表型特点。方法:从新生小鼠海马、嗅球提取神经干细胞。选取3代后稳定的神经干细胞采用Brd U进行标记,并进行Brd U+巢蛋白+Hochest33258免疫荧光复合染色对神经干细胞进行鉴定。体外诱导促使神经干细胞贴壁分化,对分化产生的子代细胞进行Brd U、β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白、Hochest33258复合免疫荧光染色确定分化表型。结果与结论:来源于新生鼠海马及嗅球的细胞连续传代培养后可形成稳定悬浮的类球状细胞团,且Brd U+巢蛋白免疫荧光双染阳性。神经干细胞体外诱导贴壁分化后可产生β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白阳性的子代细胞。以上结果表明体外培养的神经干细胞具有很强的自我增殖更新的能力,在培养过程中趋向于形成稳定的神经球,经体外诱导通过不对称细胞增殖、分化产生神经元和星形胶质细胞等细胞表型。

糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化及凋亡的影响

背景:缺氧作为神经系统疾病发展过程中诸多病理因素中最常见的因素之一,对于内源性神经干细胞以及移植后外源性神经干细胞的存活、迁移、分化、凋亡发挥着诸多调控作用。目的:系统观察糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化、凋亡的影响。方法:从新生鼠嗅球分离培养出神经干细胞,建立糖氧剥夺模型,免疫荧光技术检测糖氧剥夺后神经干细胞分化能力,MTT法检测糖氧剥夺24,48 h后恢复正常条件培养对神经干细胞增殖能力的影响,Hochest33258荧光染色检测糖氧剥夺24,48 h后神经干细胞凋亡状况。结果与结论:第4代神经干细胞CD133免疫荧光鉴定结果呈阳性表达,MTT细胞增殖能力检测结果示:糖氧剥夺组增殖能力明显低于常氧组(P<0.05),糖氧剥夺48 h组增殖能力低于糖氧剥夺24 h组(P<0.05)。GFAP、β-TubulinⅢ细胞免疫荧光染色结果示糖氧剥夺48 h后神经干细胞分化为星形胶质细胞、神经元总数明显低于常氧组(P<0.05)。Hochest33258染色凋亡率检测结果示糖氧剥夺组细胞凋亡率明显高于常氧组(P<0.01),糖氧剥夺48 h组神经干细胞凋亡率显著高于糖氧剥夺24 h组(P<0.01)。上述结果表明糖氧剥夺对神经干细胞增殖、分化、凋亡造成不利影响,影响程度取决于缺氧浓度、缺氧时间及自身对于缺氧的耐受性。

炎性细胞因子对神经干细胞增殖与分化的调节

一、前言 神经干细胞（neural stem cells,NSCs）因其自我更新和多向分化能力作为新生神经细胞的有效来源为干细胞替代治疗及募集治疗中枢神经系统（central nervous system,CNS）疾病带来了曙光。体内外NSCs受诸多细胞因子调控,传统观念认为绝大多数调节NSCs的因子与免疫源性因子无关。

神经干细胞对创伤性脑损伤的修复作用

目的建立小鼠创伤性脑损伤动物模型,进行神经干细胞移植,以评价神经干细胞对创伤性脑损伤的修复作用。方法体外培养神经干细胞并进行标记、鉴定,采用改良的Feeney氏自由落体法撞击构建创伤性脑损伤动物模型,脑外伤后1d进行神经干细胞移植,分别在移植当天(移植后0 d)、移植后3 d、7 d、14 d、21 d进行神经功能损伤程度(NSS)评分及疲劳转棒测试,移植后7 d、21 d进行抗Brdu、Nestin、GFAP、β-TubulinⅢ免疫荧光染色。结果移植后7 d、14 d、21 d神经干细胞移植组的NSS评分低于对照组,有统计学差异(P<0.05);移植后14 d、21 d神经干细胞移植组的疲劳转棒时间长于对照组,有统计学差异(P<0.05);移植后7 d免疫荧光染色发现BrdU/Nestin双阳性细胞,移植后21 d免疫荧光染色发现BrdU/GFAP双阳性细胞及BrdU/β-TubulinⅢ双阳性细胞。结论神经干细胞移植能够改善创伤性脑损伤后的神经功能,移植的神经干细胞能够在宿主脑内存活、迁移并在受损区域分化成星形胶质细胞和神经元。

新生小鼠脊髓神经干细胞的分离、培养及鉴定

目的从新生小鼠脊髓分离、培养神经干细胞,并对其增殖、分化特性进行鉴定,为进一步研究脊髓神经干细胞的移植疗法奠定基础。方法在显微镜下取6只新生小鼠的脊髓组织,采用酶消化法联合机械法将其制备成单细胞悬液,并在无血清培养基中培养。应用CD133染色、巢蛋白染色后Hoechst33258对细胞核染色;Brd U标记后行巢蛋白染色、微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白染色,Hoechst33258复染胞核;对干细胞及其分化产物进行鉴定。结果从小鼠脊髓中分离出的神经干细胞CD133、巢蛋白染色反应阳性;贴壁神经球巢蛋白染色阳性;其诱导分化产物微管蛋白和胶质纤维酸性蛋白染色阳性。结论采用酶消化法联合机械法对脊髓神经干细胞行传代和培养,能够成功获得具有增殖分化特性的干细胞。