抑郁症大鼠内侧前额叶皮层PNNs表达及GABA能神经元功能改变

目的:探究慢性不可预见性温和应激(CUMS)诱导的抑郁模型大鼠内侧前额叶皮层(mPFC)中神经元周围基质网络(PNNs)与γ-氨基丁酸(GABA)能神经元功能的变化。方法:将28只大鼠随机分为两组,模型组采取CUMS建立抑郁模型,对照组不做任何处理。采用免疫荧光双标技术检测PNNs密度以及PNNs与小清蛋白(PV)双标阳性神经元(PNNs+PV+)占PV阳性(PV+)神经元百分比;Western印迹法检测大鼠PNNs主要组分蛋白聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、短小蛋白聚糖(Brevican)、GABA主要合成酶谷氨酸脱羧酶67(GAD67)的蛋白表达。结果:模型组mPFC脑区PNNs密度及PNNs+PV+神经元占PV+神经元百分比较对照组均降低,差异具有统计学意义(P<0.05);模型组mPFC脑区中Aggrecan、Brevican及GAD67蛋白表达水平较对照组减少,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:慢性不可预见性温和应激造模的抑郁症模型大鼠mPFC脑区PNNs表达及GABA主要合成酶GAD67蛋白表达水平下降。

清肺排毒汤干预新冠肺炎细胞因子风暴机制的网络药理学研究

目的:通过网络药理学从细胞因子风暴角度探讨清肺排毒汤治疗新型冠状病毒肺炎的可能机制。方法:利用TCMSP、SymMap数据库筛选出清肺排毒汤的活性成分及靶标;通过GeneCards数据库筛选新冠肺炎的预测靶点;将两者靶点进行映射;利用STRING数据库和Cytoscape3.7.2软件构建药物-活性成分-靶点网络图并筛选出核心成分及靶点;再通过OmicShare云平台、David分别进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。结果:共获得52个清肺排毒汤治疗新冠肺炎的潜在靶点,17个与炎症相关的核心靶点,主要包含有IL、IFN、TNF等细胞因子和趋化因子,和26个核心成分,包括槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素和汉黄芩素等;GO富集结果中与炎症相关的生物过程224条,分子功能15条,细胞组成33条;KEGG富集结果中与炎症相关的信号通路5条,包括TNF信号通路、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、MAPK信号通路和细胞因子受体相互作用。结论:清肺排毒汤通过多成分作用于多靶点、多通路,达到抑制细胞因子风暴,从而治疗新冠肺炎的作用。

麻黄-苍术治疗新型冠状病毒肺炎机制的网络药理学探讨

目的:通过网络药理学探究麻黄-苍术治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的作用靶点及信号通路,阐述其作用机制。方法:利用TCMSP、BATMAN-TCM数据库和相关文献筛选出麻黄-苍术的活性成分及靶标;通过GeneCards数据库筛选2019-nCoV的预测靶点;将两者靶点进行映射;利用Cytoscape3.7.2数据库构建活性成分-靶点网络图并筛选出核心靶点;再通过GOEAST、DAVID分别进行GO生物过程、KEGG通路富集分析。结果:根据筛选条件共获得麻黄-苍术活性成分32个,潜在作用靶点216个;与2019-nCoV共同靶点48个,关键靶点10个;获得1303条GO生物过程,在细胞生物过程正调控、生物节律调节、细胞对刺激的反应等方面靶点富集较集中;56条KEGG信号通路,靶点在甲型流感、百日咳、肺结核、乙型肝炎等通路上富集较多。结论:麻黄-苍术通过多靶点、多通路起到抗病毒、抑菌退热、止咳化痰、调节免疫的作用,最终达到治疗COVID-19的效果。

MTHFR C677T基因多态性与孤独症谱系障碍易感性关系的Meta分析

目的探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性与孤独症谱系障碍(ASD)易感性的关系。方法检索中国知网、万方数据、PubMed、Embase、Proquest、Web of science等数据库,收集MTHFR C677T基因多态性与ASD关联的病例对照研究,检索时间至2020年6月30日。应用Stata 14.0软件进行Meta分析。结果共纳入16篇文献,其中病例组2149例,对照组2251例。Meta分析结果显示在等位基因模型(T vs.C,OR=1.51,95%CI:1.15~1.99,P=0.003)、显性模型(TT+CT vs.CC,OR=1.67,95%CI:1.21~2.29,P=0.002)中,MTHFR C677T多态性与ASD发生具有相关性。而在隐性模型(TT vs.CT+CC,OR=1.20,95%CI:0.82~1.76,P=0.340)和纯合子模型(TT vs.CC,OR=1.43,95%CI:0.92~2.22,P=0.113)中MTHFR C677T多态性与ASD易感性无关。种族亚组分析显示,高加索人MTHFR C677T多态性仅在显性模型(OR=1.30,95%CI:1.04~1.63,P=0.024)中与ASD发生相关,而亚洲人在等位基因模型(OR=1.85,95%CI:1.13~3.01,P=0.014)和显性模型(OR=1.99,95%CI:1.18~3.36,P=0.010)中和ASD发病有关。结论MTHFR C677T基因多态性与ASD易感性相关。

稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株构建

目的构建稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒及神经母细胞瘤细胞株,为进一步探讨Drp1基因在帕金森病(PD)发病过程中的作用提供细胞模型。方法于GenBank中检索人Drp1基因的核苷酸序列,设计并筛选最佳动力学参数的干扰序列及阴性对照序列;根据靶序列分别设计并合成干扰RNA(siRNA)的单链DNA寡核苷酸(DNAoligo),与退火缓冲液反应后形成带黏性末端的双链DNAoligo片段。分别用AgeⅠ与EcoRⅠ双酶切双链DNAoligo片段和GV248慢病毒骨架质粒后,加入T4DNA连接酶连接,得到重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒。将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi加入到大肠杆菌TOP10感受态细胞中反应后,分别提取质粒DNA并进行DNA测序。将重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi和阴性对照质粒转染至293T细胞中,培养48h后收集上清液,离心后过滤得到Drp1-RNAi重组慢病毒和阴性对照慢病毒。将人神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y分为Drp1-RNAi重组慢病毒组(D组,用Drp1-RNAi重组慢病毒感染)、阴性对照组(N组,用阴性对照慢病毒感染)、正常对照组(C组,正常培养),采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞Drp1mRNA,采用Westernblotting法检测各组细胞Drp1蛋白。结果重组慢病毒载体质粒Drp1-RNAi的DNA序列与设计的干扰序列完全一致。D组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为0.47±0.12和0.40±0.04,N组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为1.12±0.33和0.67±0.05,C组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量为1.02±0.23和0.72±0.02;D组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量与N组、C组相比,P均<0.05;N组Drp1mRNA和蛋白的相对表达量与C组相比,P均>0.05。结论成功构建了稳定干扰Drp1基因的慢病毒载体质粒,并建立、筛选出了稳定干扰Drp1基因的神经母细胞瘤细胞株,进一步探讨Drp1基因在PD发病过程中的作用提供细胞模型。

针刺联合美多芭对帕金森病小鼠脑多巴胺神经元及蛋白激酶B表达的影响

目的通过观察针刺舞蹈震颤控制区联合美多芭对帕金森病(PD)小鼠脑内蛋白激酶B(Akt)表达的影响来探讨针刺联合美多芭对多巴胺(DA)能神经元的保护作用及可能机制。方法将C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、模型组、美多芭组、针刺组和针刺联合美多芭(简称针美)组。应用腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)的方法建立PD小鼠模型,后3组在造模后采取不同治疗措施,造模后小鼠存活28 d。采用爬杆法观察小鼠行为学;免疫组织化学技术检测小鼠中脑黑质致密部多巴胺神经元的丢失程度及脑Akt的表达。结果 3个治疗组小鼠行为学爬杆时间均较模型组有明显缩短(P<0.05)。造模后,小鼠黑质致密部多巴胺神经元表达较正常组减少(P<0.05),其中针美组多巴胺神经元表达较模型组及美多芭组增多(P<0.05)。在黑质致密部,针美组Akt与其余各组相比,表达明显升高(P<0.05);在海马部位,针美组在CA1、CA3和CA4区的表达比模型组和美多芭组明显升高(P<0.05),在CA1和CA4的表达比针刺组有明显上升(P<0.05)。结论针刺舞蹈震颤控制区特别是再给予美多芭复合治疗可能通过调节脑磷酯酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/Akt通路,从而达到治疗PD的目的。

以上诉不加刑为例论证程序公正与实体公正的冲突及协调

程序公正与实体公正是司法公正的两个维度，二者的统一协调是我们追求的理性状态，但受法制发展与认识局限性的制约，两者不可避免地会产生冲突。本文试以上诉不加刑为例，对实体公正与程序公正的关系以及二者发生冲突时的选择与取舍等问题进行一些探讨。

Parkin基因过表达质粒和细胞模型的构建

目的:构建Parkin基因过表达质粒并转染SH-SY5Y细胞,为进一步研究帕金森病的发病机制及中药的作用环节奠定基础。方法:首先构建Parkin基因过表达质粒,采用脂质体转导技术,将Parkin过表达质粒应用Lipo3000转染SH-SY5Y细胞。荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR检测其Parkin mRNA的表达;Western Blot技术检测其Parkin蛋白的表达。结果:转染组可观测到较多的绿色荧光蛋白表达;Parkin过表达细胞Parkin mRNA和蛋白的表达均显著提高(P<0.01)。结论:通过脂质体转导技术,应用Lipo3000可将Parkin过表达质粒成功转染入SH-SY5Y细胞,转染的基因和蛋白表达均较高,提示此法可成功构建Parkin基因过表达的细胞模型。

补阳还五汤及其拆方对缺血性中风气虚血瘀证大鼠脑血流及脂质代谢的影响

目的建立缺血性中风气虚血瘀证病证结合大鼠模型,观察补阳还五汤及拆方对缺血性中风气虚血瘀证大鼠脑血流及脂质代谢的影响以探讨中药复方的作用机制。方法多因素复合模拟法制备气虚血瘀证模型后再采用线栓法制备缺血性中风大鼠模型。按随机数字表法将雄性SD大鼠分为正常组、模型组、补气拆方组(10.8 g/kg)、活血拆方组(2.2 g/kg)、补阳还五汤组(13.1 g/kg)、辛伐他汀组(10.0 mg/kg),各给药组灌胃相应的药物,正常组和模型组灌胃等量的蒸馏水,连续灌胃7 d后取材并检测指标。气虚证、血瘀证及神经功能评分法评价病证结合模型是否成功;激光散斑血流成像系统观察局部脑血流量(rGBF);全自动生化分析仪检测血胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平;蛋白质印迹法检测脑组织中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及其磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)的表达。结果与正常组相比,模型组rGBF值、HDL-C水平降低(P<0.05),CHO、TG、LDL-C水平升高(P<0.01),AMPK、p-AMPK蛋白表达量降低(P<0.01)。给药7 d后,与模型组相比,补阳还五汤组及补气拆方组气虚证、血瘀证及神经功能评分均降低(P<0.05,P<0.01);各给药组rGBF值、AMPK及p-AMPK蛋白表达量均升高(P<0.01),血清TG水平均降低(P<0.01);补阳还五汤组及辛伐他汀组HDL-C水平升高(P<0.05),CHO、LDL-C水平降低(P<0.05,P<0.01);辛伐他汀组、补阳还五汤组及补气拆方组p-AMPK/AMPK比值升高(P<0.05)。结论补阳还五汤能通过改善脂质代谢状态,调整脑血流,从而发挥防治缺血性中风气虚血瘀证的作用,方中的补气药和活血药具有协同作用。

大补阴丸、牵正散及合方对帕金森小鼠脑神经元及其线粒体复合物酶活性的保护作用

目的:通过大补阴丸、牵正散及合方对帕金森病(PD)小鼠脑线粒体复合物酶Ⅳ(COX)活性及其亚基COXⅠmRNA相关作用的研究,探讨中药的神经保护机制。方法:采用腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)建立PD模型。75只C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、模型组、大补组、牵正组和合方组,每组15只。采用爬杆法测量小鼠行为学,应用HE染色观察中脑黑质病理学变化;免疫组织化学法检测TH阳性神经元数目;测定脑内COX的活性及其亚基COXⅠmRNA表达情况。结果:造模28d后,与模型组比较,3个中药治疗组能显著缩短PD小鼠的平均爬杆时间(P<0.05),增加中脑黑质神经元数目,改善神经元形态,并能明显减少TH阳性神经元丢失(P<0.05),提高COXⅠmRNA的表达(P<0.05),合方组可显著增加线粒体复合物酶Ⅳ活性(P<0.05)。结论:大补阴丸、牵正散及合方能提高PD小鼠脑COXⅠmRNA表达,且合方能改善PD小鼠脑线粒体复合物酶Ⅳ的活性,以维持正常线粒体功能,发挥神经保护作用。

知母皂苷B-Ⅱ对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞帕金森病模型线粒体的保护作用

目的探讨知母有效成分知母皂苷B-Ⅱ对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导的帕金森病细胞模型线粒体的保护作用。方法选择人多巴胺能神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞,用MPP+处理建立帕金森病细胞模型,分别采用终浓度为0.3、1.0、3.0μmol/L知母皂苷B-II干预。CCK-8法检测各组细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞活性氧(ROS)水平,激光扫描共聚焦显微镜拍照检测线粒体活性,Image J软件计算线粒体形态因子、网络分支平均长度及网络分支数,JC-1法检测线粒体膜电位,荧光素酶法检测细胞ATP水平。结果与模型组比较,知母皂苷B-II低、中、高浓度组细胞存活率均上升(P<0.05或P<0.01)、凋亡率降低、线粒体活性提高,形态因子升高、网络分支平均长度及网络分支数增多,拮抗膜电位降低、相对ATP水平均上升、细胞ROS水平均升高(P<0.01),并且观察到知母皂苷B-II中浓度组在拮抗膜电位的降低、提高ATP水平作用更为明显。结论知母皂苷B-II可改善MPP+对SH-SY5Y细胞线粒体功能的损伤,拮抗膜电位的降低、增加ATP生成、降低ROS产生,修复线粒体网络形态,从而减少细胞凋亡,达到治疗帕金森病的作用。

补阴牵正方对帕金森病细胞模型氧化应激损伤的保护作用及机制研究

目的:通过对补阴牵正方抗氧化应激减少帕金森病(PD)细胞模型凋亡的研究,探讨中药治疗PD的作用机制。方法:利用1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导构建PD细胞模型,将SH-SY5Y细胞分为正常组、模型组和中药组。采用CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率和活性氧(ROS)水平,酶标仪检测细胞丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力,Western blot检测细胞色素C(Cyt C)蛋白的表达。结果:与正常组比较,MPP+处理后,细胞存活率和SOD活力显著下降(P<0.01),细胞凋亡率、ROS水平、MDA含量及Cyt C蛋白表达水平均显著增高(P<0.01)。与模型组比较,中药干预后,PD细胞模型存活率和SOD活力显著上升(P<0.01),凋亡率、ROS水平、MDA含量及Cyt C蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)。结论:补阴牵正方可以改善氧化应激,减少PD细胞模型凋亡,从而发挥对PD的神经保护作用。

人PINK1-shRNA载体的构建及对神经母细胞瘤细胞线粒体的影响

目的:构建筛选人源靶向特异PINK1-shRNA敲减质粒,转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞并验证该质粒转染后对PINK1基因的敲减效率,观察对细胞线粒体形态的影响。方法:构建两对人源PINK1-shRNA序列(编号分别为PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42),将这2对干扰序列连接在载体上形成重组载体,经测序验证后,将空载体和两对敲减质粒分别转染SH-SY5Y细胞,获得基因敲减的细胞模型,用CCK-8法检测细胞的存活率,用荧光定量PCR方法确定PINK1基因的敲减效率,用蛋白质免疫印迹法验证细胞内PINK1的表达水平是否发生改变,用激光共聚焦显微镜观察线粒体的形态是否发生了改变。结果:我们提取的质粒,经测序结果显示,质粒载体构建成功;转染细胞后,CCK-8法检测细胞存活率发生了降低,与正常组比较,PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42敲减质粒组,细胞的存活率分别降低了13.7%(P<0.05)和14.1%(P<0.05);荧光定量PCR结果显示,与正常组相比,PINK1-shRNA-39组和PINK1-shRNA-42组敲减质粒转染的细胞内PINK1基因的表达分别降低了24.1%(P<0.01)和36.7%(P<0.01);蛋白质印迹法结果显示,与正常组相比,两对质粒分别转染细胞后,PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42敲减质粒转染的细胞内PINK1蛋白的表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01),PINK1-shRNA-42敲减质粒转染的细胞内PINK1蛋白的表达水平有效降低更明显;与正常组比较,激光共聚焦显微镜观察到基因敲减两组细胞的线粒体部分发生断裂,碎片较多,基因敲减两组的线粒体的形态因子显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:成功构建了人源的PINK1基因敲减的质粒,并将敲减的质粒成功转染至SH-SY5Y细胞中,细胞内PINK1基因的m RNA和蛋白的表达水平降低,且细胞线粒体的形态发生了改变。

基于Drp1-Ser637磷酸化探讨补阴牵正方对PD小鼠脑线粒体的影响

目的通过帕金森病(PD)小鼠脑动力相关蛋白1(Drp1)和其磷酸化位点丝氨酸637(Ser637)表达的变化及对脑线粒体的影响探讨补阴牵正方防治PD的可能机制。方法选用C57BL/6小鼠72只,随机分为正常组、模型组、补阴牵正方组、美多芭组,每组18只。除正常组外,其余3组小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)建立PD模型,补阴牵正方组灌胃补阴牵正方水煎剂,每天灌胃2次,连续28 d,美多芭组腹腔注射美多芭,隔天1次,共28 d。爬杆法、抓握法观察小鼠行为学;免疫荧光组化法观察中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数目;荧光素酶法测定脑线粒体三磷酸腺苷(ATP);JC-1法检测脑线粒体膜电位;蛋白印迹法(Western blot)检测脑蛋白Drp1及其磷酸化蛋白Drp1-Ser637表达。结果相比正常组,模型组小鼠爬杆时间延长(P<0.01),抓握力度减弱(P<0.01),黑质TH阳性神经元数目减少(P<0.01),脑线粒体膜电位及ATP水平降低(P<0.01),脑Drp1蛋白表达增加(P<0.01),Drp1-Ser637磷酸化蛋白表达降低(P<0.01)。与模型组相比,补阴牵正方组小鼠在第14天爬杆时间缩短、握力明显增加(P<0.05),黑质TH数目明显增加(P<0.05),Drp1蛋白表达减少(P<0.01),Drp1-Ser637磷酸化蛋白表达增加(P<0.05),脑线粒体膜电位及ATP水平显著升高(P<0.01);而美多芭组除在第14天行为学较模型组有明显改善外(P<0.05),其余指标均无统计学差异;补阴牵正方组与美多芭组比较其黑质TH数目、ATP水平及膜电位均有差异(P<0.05,P<0.01),Drp1-Ser637磷酸化蛋白表达也显著增加(P<0.01)。结论补阴牵正方可能通过下调维持线粒体动态平衡的分裂蛋白Drp1、上调Drp1-Ser637磷酸化位点的表达改善PD小鼠脑线粒体功能,从而保护中脑黑质多巴胺神经元达到防治PD的作用。