Δ~6-脂肪酸脱氢酶的分子生物学研究进展

包括γ_亚麻酸在内的多不饱和脂肪酸由于在人类健康中的重要作用而成为有价值的产品 ,目前市场上对γ_亚麻酸的需求持续增长 ,然而当前来源难以满足市场的需求 ,寻找合适的替代来源将有助于解决这一问题。Δ6 _脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶 ,这里从Δ6 _脂肪酸脱氢酶的基因克隆、结构和功能的研究、系统进化和基因工程应用等方面探讨了Δ6 _脂肪酸脱氢酶的研究进展。

少根根霉Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

根据真菌Δ6 脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行RT PCR ,获得一个 5 93bp的cDNA片段 ,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物 ,通过cDNA末端扩增技术 (RACE)获得该cDNA的 3′和 5′序列 ,从而得到全长为 14 82bp的cDNA序列。序列分析结果表明 ,该序列具有一个长度为 1377bp、编码 4 5 8个氨基酸的开放阅读框 ,所编码蛋白质的大小为 5 2kD。与报道的Δ6 脂肪酸脱氢酶一样 ,推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的 3个组氨酸保守区和疏水结构 ,在其氨基酸序列的N 末端具有类似于细胞色素b5的血红素结合区。该序列为一个新的编码Δ6 脂肪酸脱氢酶的基因 ,为了验证其功能 ,把开放阅读框序列RAD6亚克隆到表达载体 pYES2 0 ,构建重组表达载体pYRAD6 ,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达。通过气相色谱(GC)和气相色谱 /质谱 (GC MS)分析表明 ,该序列在酿酒酵母中获得表达。所编码的酶具有Δ6 脂肪酸脱氢酶活性 ,能将外源性的底物亚油酸转化为γ 亚麻酸 ,γ 亚麻酸的含量占酵母总脂肪酸的 3 85 %。

转译起始密码子周边序列的改变对Δ~6-脂肪酸脱氢酶基因表达的影响

将少根根霉中Δ6_脂肪酸脱氢酶基因 (RAD6 )的起始密码子周边序列作适当的修改 ,并把修改后获得的片段(RAD6_1 )亚克隆到表达载体pYES2 0 ,构建重组表达载体pYRAD6_1。经测序验证 ,把pYRAD6_1转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVScl进行表达分析 ,同时以空载体pYES2 0和出发序列所构建的pYRAD6作为对照。通过气相色谱 (GC)和气相色谱 质谱 (GC_MS)分析表明 ,在pYRAD6和pYRAD6_1转化的酿酒酵母中生成γ_亚麻酸 ,而pYES2 0中没有检测到。其中 ,pYRAD6_1转化的酿酒酵母γ_亚麻酸表达量占细胞总脂肪酸含量的 5 2 3% ,而对照pYRAD6转化的酿酒酵母中表达量只占 2 6 4 %。

Δ~6-脂肪酸脱氢酶对n-6和n-3途径中脂肪酸底物的偏好

添加α 亚麻酸作为底物 ,经半乳糖诱导 ,在含有少根根霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的酿酒酵母总脂肪酸中检测到十八碳四烯酸的生成 ;同时添加亚油酸和α 亚麻酸时 ,检测到γ 亚麻酸和十八碳四烯酸生成 ,而且十八碳四烯酸的含量是γ 亚麻酸含量的 3 81倍 ,表明在酿酒酵母中少根根霉Δ6 脂肪酸脱氢酶不仅能催化α 亚麻酸生成十八碳四烯酸 ,而且偏好n 3途径中的底物α 亚麻酸。同样 ,在改变少根根霉Δ6 脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列后所构建的转基因酵母中 ,也得到类似的结果 。