我国科技创新任重道远

改革开放三十年是中国发展进步的三十年,也是不断追求科技创新的三十年,如何总结和认识科技创新三十年的成就和经验?目前我国科技创新的环境怎样?今后如何进一步推动科技创新?本期笔谈我们邀请了几位专家学者,就以上问题展开论述,以飨读者。

新疆3种雅罗鱼线粒体DNA控制区序列的差异和系统进化关系

对分布在新疆的准噶尔雅罗鱼 (Leuciscusmerzbacheri)、贝加尔雅罗鱼 (Leuciscusleuciscusbaicalensis)和高体雅罗鱼 (Leuciscusidus) 3个鱼种共 2 4尾个体的线粒体DNAD loop控制区核苷酸序列进行了测定 ,获得 2 4条长度为 6 6 7～ 6 6 9bp的同源基因序列。 3种雅罗鱼之间的序列差异在 6 39%～ 9 89%之间 ,贝加尔雅罗鱼与高体雅罗鱼种间序列同源性高 ,变异程度小 ;贝加尔雅罗鱼与准噶尔雅罗鱼种间序列同源性最低 ,变异程度最大。所采集的贝加尔雅罗鱼两个地理群体 (赛里木湖和额尔齐斯河 )内mtDNA的平均核苷酸碱基序列差异为 1 0 7%和 1 0 8% ;两群体间的序列差异为 1 0 7% ,显示两个地理群体间无明显分化。DNA序列数据显示 ,这 3种鱼类线粒体DNAD loop序列变异丰富 ,2 4尾个体呈现独自的单倍型。同源基因序列平均含AT碱基 6 4 1% ,GC碱基 35 9% ,显示准噶尔雅罗鱼、贝加尔雅罗鱼、高体雅罗鱼的线粒体DNAD loop区核苷酸组成的不均一性。分子系统树提示 ,贝加尔雅罗鱼与高体雅罗鱼亲缘关系较近 ,准噶尔雅罗鱼是 3种雅罗鱼中较古老的鱼种。

新疆三种雅罗鱼属鱼类mtDNA D-loop多态性及起源分化分析

用PCR-RFLP技术,对新疆分布的准噶尔雅罗鱼、贝加尔雅罗鱼和高体雅罗鱼的mtDNA D-loop高变区约827bp进行了扩增,用ScaI、HinfI、AluI、DdeI4种限制性内切核酸酶对56个样本的扩增产物酶切和RFLP分析,共检测到6种单倍型。准噶尔雅罗鱼存在2种单倍型:BDAA和BDBA;贝加尔雅罗鱼存在3种:AAAA、ABAA和ACAA;高体雅罗鱼只有1种。初步认为,准噶尔雅罗鱼、贝加尔雅罗鱼存在较丰富的群体内变异。用6种单倍型及净遗传距离绘制的UPGMA分子系统树,提示准噶尔雅罗鱼有可能是原始种,贝加尔雅罗鱼和高体雅罗鱼是由准噶尔雅罗鱼进化而来。

荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因组BAC文库的构建与分析

采用未培养技术和脉冲场电泳技术直接从瘤胃微生物提取到大小在2Mb左右混合微生物DNA,经HindⅢ不完全酶切获得50～100kbDNA片段,将其连接在pCC1BAC载体上,转化E.coliEPI300,得到瘤胃微生物BAC文库,经对文库的鉴定分析,该文库的平均插入片段54.5kb,空载体率小于2%,库容837Mb,共保存15360个克隆。通过对该文库进行部分酶活性筛选,获得具有淀粉酶活性的克隆16个;纤维素酶活性的克隆26个,而且能降解纤维素的克隆中25个呈现多酶活性。这些结果表明该文库具有重要研究价值。

绵羊FGF5基因的克隆、表达及RNA干扰

根据牛的成纤维细胞内生长因子5(Fibroblast growth factor 5,FGF5)基因cDNA序列设计引物,PCR扩增得到绵羊FGF5基因cDNA的开放阅读框序列,并比较和其他6种高等哺乳动物的序列同源性;同时研究该基因在绵羊多种组织的表达情况,以及研究以细胞模型RNA干扰下的表达情况。结果表明,绵羊FGF5基因ORF全长为813 bp,编码270个氨基酸,分子量约为29.58 kDa,理论等电点10.59。绵羊FGF5基因cDNA序列与牛、人、小鼠、大鼠、犬和猫的对应序列同源性高度保守,预测氨基酸序列同源性同样具有高度保守性。RT-PCR分析表明FGF5在绵羊皮肤、小肠、肾脏、心脏、肝脏、脾脏、胰脏和肺中均有表达,皮肤中表达量最高。构建该基因的原核表达载体和RNAi载体,IPTG诱导在大肠杆菌中融合表达获得55 kDa的蛋白条带,设计的RNA干扰片段能显著抑制FGF5基因的表达。文章为进一步阐明绵羊FGF5的功能尤其是在羊毛生长发育中的作用提供了理论和实验基础。

新疆7个绵羊品种MHC区段微卫星遗传多样性的分析

为分析新疆北疆地区主要绵羊品种的遗传多样性和系统发生关系,利用SSR Hunter软件寻找5个微卫星标记,采用PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳,对新疆7个品种绵羊群体遗传多样性进行了检测分析,统计了各群体的等位基因组成、平均有效等位基因数和平均基因纯合率,利用等位基因频率计算出各群体的平均遗传杂合度、多态信息含量和群体间的遗传距离。结果显示新疆7个绵羊群体共发现28个等位基因,实验证明在5个微卫星位点的平均多态信息含量为0.5569~0.7335,平均杂合度为0.6208~0.7437,有效等位基因数为2.7118~4.4203,均属于高度多态性位点。聚类分析和主成分分析结果与其起源、育成历史及地理分布基本一致。这5个位点作为与生产性能相关的遗传标记较为理想。

新疆军垦型细毛羊基因组BAC文库的构建

选用新疆特有的军垦型细毛羊为材料,构建了含有190464个克隆的全基因组BAC文库.文库的平均插入片段大小为133kb,同时文库92.5%克隆插入片段大于100kb,而且有部分克隆甚至大于300kb,这将满足大多数基因筛选的要求.假定绵羊的基因组含有3×106kb,根据文库的平均插入片段大小为133kb,计算的文库基因组覆盖率为8倍.因此,从文库筛选到目的片段的概率为98.208%.该文库中插入的外源片段来自新疆军垦型细毛羊的基因组,这对于研究新疆军垦型细毛羊的特殊性状的基因与其它绵羊品种和物种之间的差异,以及构建其全基因组物理图谱和基因图谱的完善是非常有利的.

利用改进的手工克隆技术生产转GFP基因猪克隆胚胎

通过体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)培育转基因动物新个体是当前被广泛使用的技术之一,但其生产成本高和转基因囊胚形成率低在很大程度上制约了该技术的应用。文章报告对该技术的一些改进以提高其成功率并降低成本。首先将增强型绿色荧光基因(EGFP)导入猪胎儿成纤维细胞中,通过荧光观察EGFP的表达来筛选适合做细胞核移植的体细胞。这样避免了外源EGFP基因虽已整合至猪基因组但不表达的情况,保证供体细胞100%是表达目标蛋白(绿色荧光蛋白)的细胞;然后利用新一代体细胞核移植技术——手工克隆技术(Handmade cloning,HMC)将供体细胞与卵母细胞融合生产胚胎。共收集了4个批次378个肉用家猪的卵母细胞,经体外培养成熟后手工去核得到266个去核卵母细胞,与EGFP细胞融合后获得127个重构胚胎,将重构胚胎体外培养到144 h,得到转基因囊胚65个,平均囊胚率为52.1±8.3%。与传统SCNT相比,HMC不仅操作简便,而且能大幅提高核移植细胞的囊胚率。更为重要的是,改进的手工克隆技术摆脱了昂贵的显微操作仪,为产业化生产转基因动物提供了新的实用基础。

遗传修饰技术在绵羊分子设计育种中的应用

利用遗传修饰技术可以使动物在遗传水平发生改变,实现在个体内表达外源基因或对其内源基因的功能造成影响。在动物育种中,可以利用遗传修饰技术在分子水平进行设计并实现品种的快速改良。从传统的遗传修饰技术、病毒载体、精子载体等介导的遗传修饰技术到新型人工核酸酶介导的基因编辑技术,尤其是CRISPR/Cas9为代表的人工核酸酶的运用使得基因编辑动物的制备变得更加高效快捷,并迅速在多个物种中得到应用。这些方法也已经拓展到了绵羊(Ovis aries)遗传育种领域。利用遗传修饰技术在绵羊中进行分子育种比传统的育种方式具有更大的优势,可以使用多种策略直接对性状进行快速改良,并且可以加快育种进程。本文详细介绍了遗传修饰技术在绵羊中的研究历程,探讨了通过遗传修饰技术进行绵羊分子设计育种的可能性,并提出以上技术和方法在绵羊育种中面临的问题和挑战。

外源性人TIMP-1基因在转基因小鼠染色体上的整合及定位

为探讨外源基因人基质金属蛋白酶组织抑制物-1（human tissue inhibitor of metalloproteinase-1，hTIMP-1）基因在转基因小鼠家系染色体上的整合和精确定位，应用Southern印迹检测外源基因在染色体上整合的位点及拷贝数，结果表明，外源基因是以单拷贝、单位点形式整合；应用荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术检测F4～F20代转基因小鼠中外源基因的整合．结果证明，该家系转基因小鼠自F4代起是纯合子，外源基因整合在17号染色体E区；反向PCR法（Inverse PCR，IPCR）克隆出约3．8kb外源基因整合位点处的侧翼序列．分析表明，外源基因整合在17号染色体E1.3区，ALK（anaplastic lymphoma kinase，ALK）基因第23个内含子区域、结果提示，获得的转基因小鼠为纯系，外源基因hTIMP-1已稳定整合在转基因小鼠染色体上，并能遗传给后代．

小鼠线粒体DNA中一个新的R-loop结构的发现

哺乳动物线粒体DNA的D-loop区是其复制和转录的起始区域,其中D-loop重链RNA(DH-RNA)与复制和转录功能密切相关,但轻链RNA(DL-RNA)被认为没有重要的功能,因此几乎没有有关D-loop区的轻链RNA的研究。文中研究发现一个DL-RNA存在于小鼠线粒体D-loop区。研究表明这个DL-RNA跨越了几乎整个D-loop区,并且能够耐受RNaseA和RNase T1酶的切割,但对RNase H酶敏感,在这种RNA存在的情况下,D-loop的DNA不能被HaeⅢ酶切割,这些结果意味着新发现的DL-RNA能同D-loop区的DNA形成三链结构,并且能使其对应区域的DNA不被限制性内切酶消化。在以细胞色素b基因为对照的实验中没有发现类似的结构,证明这一结构不是RNA转录过程中形成的临时结构。考虑到D-loop区是线粒体DNA复制和转录的重要调控区,这个新奇的三链RNA-DNA复合物可能在线粒体DNA复制和转录中扮演了重要角色。

新疆细毛羊2倍基因组BAC文库PCR筛选系统的构建与使用

本研究所构建的BAC文库覆盖了8倍新疆细毛羊的基因组，平均插入片段的大小为133kb．同时文库92．5％的克隆插入片段大于100kb，而且有部分克隆甚至大于300kb，假定绵羊的基因组含有3×10^6kb，根据文库的平均插入片段大小为133kb，从文库筛选到目的片段的概率为98．208％。为了验证文库有较好的覆盖率．构建了2倍基因组文库PCR筛选系统，并对位于新疆细毛羊20号染色体MHC基因邻近区段的DMB_EX2、MCMA36、CP73和BM12584个分子标记进行了筛选．得到的平均阳性克隆数为1．5个，从筛选结果来看，这与文库插入片段估计的8倍基因组覆盖率相当接近并且没有偏向，这使得本文库成为研究绵羊的功能基因、位置克隆和完善基因组物理图谱的极为有用的资源。

中国美利奴绵羊MHC ClassⅡb区349I12 BAC克隆插入片段基因组成与结构分析

利用已测序的中国美利奴绵羊细菌人工染色体(BAC)文库MHC区段阳性克隆插入片段制备探针,筛选中国美利奴绵羊(新疆军垦型)混合组织cDNA文库,以期获得该MHC片段的基因组成与结构信息。用中国美利奴绵羊MHC ClassⅡb区域内的349I12 BAC克隆,BsaJⅠ酶切后制备α-32P放射性探针,以噬菌斑原位杂交筛选正常中国美利奴绵羊cDNA文库,并将分离所得的cDNA阳性克隆测序后进行基因结构分析。以349I12 BAC克隆制备探针经过两轮的噬菌斑原位杂交筛选,获得19个cDNA阳性克隆,经测序、比对等进一步分析确定获得17条不同序列,其中7条序列与免疫相关。绵羊20号染色体上的MHC区段包含表达序列,且多为断裂基因,对其基因结构的分析将有助于相应基因功能及调控方面的研究。

小鼠Mater基因选择性剪接变异体的鉴定和分析

位于小鼠第 7号常染色体的Mater (Maternalantigenthatembryosrequire)编码一个卵母细胞特异的自身抗原 ,与小鼠自免疫性卵巢退化疾病密切相关。在发现Mater基因存在选择性前切现象的基础上 ,通过RT PCR技术 ,在 3个近交品系小鼠 (CBA/J、SWR/J、B6 )中发现并初步验证了Mater基因mRNA的 4种选择性剪接变异体 ,分别命名为B、E、F、G型。其中B型与以前报道的一致 ,具有MatermRNA的全部外显子 ,E、F、G为新发现的剪接变异体 ,其选择性剪接位点都位于阅读框内。E变异体缺失了外显子 6 ,F变异体保留了部分内含子 8并且缺失了外显子 10 ,G变异体缺失了部分外显子 14 ,它们所有的内含子与外显子结合处的DNA序列都遵循“GT AG”剪接规则。B、E、F在B6、CBA/J和SWR/J小鼠品系中均存在 ,G仅存在于SWR/J。根据新发现的 3种剪接变异体的cDNA序列推导出对应的预期蛋白异形体的氨基酸序列 。

中国美利奴绵羊MHC 222G18 BAC克隆的基因筛选与结构分析

绵羊主要组织相容性复合体(MHC)是与控制绵羊抗病性和易感性紧密连锁的基因簇。为了深入了解该类基因的组成与结构,利用中国美利奴绵羊细菌人工染色体(BAC)文库MHC区段克隆222G18,经BsaJⅠ酶切后制备α-32P放射性探针,通过噬菌斑原位杂交技术筛选中国美利奴绵羊cDNA文库,经过两轮杂交筛选,获得12个cDNA阳性克隆,经测序、比对等生物信息学分析确定获得7条与免疫相关的序列,其中3条具有完整的编码序列。利用SIM4软件将7条序列定位到BAC克隆上,结果显示绵羊MHC区段的表达序列多为断裂基因且跨度很大,可能是形成其基因多样性的重要原因之一。

线虫fat-1基因的原核表达、纯化及其抗体的制备

通过RT-RCR得到线虫f a t-1基因全长,将其N端亲水区克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建重组质粒pGEX-f a t1-N,将其转化大肠杆菌,并进行诱导表达。对表达产物G ST-f a t1-N融合蛋白进行纯化,制备其抗体,并对抗体效价进行了检测。结果表明,线虫f a t-1基因能在大肠杆菌中表达,制备的抗体能识别在原核表达系统内表达的G ST-f a t1-N融合蛋白,且效价很高,达到1∶107。

绵羊钙调蛋白调节基因Calponin h1的分子克隆

在一项研究中发现,雌激素受体在胚胎发育后期对绵羊子宫平滑肌Calponin(CaP)基因的活动有明显上调作用,而CaP一直被作为观察其他基因表达水平变化的基准参照基因(ReferenceGene)。迄今为止,绵羊CaP尚未完整克隆,为进一步了解其结构和功能,根据人、小鼠和家猪的同源保守区序列设计锚定寡核苷酸引物,通过5′RACE及3′RACE方法克隆了绵羊子宫平滑肌组织全长CaPh1cDNA(GenBank登录号:AY327118),在cDNA序列的基础上,又通过PCR SSP方法获得了CaPh1基因除内含子1、2之外的其余4个内含子全部序列(GenBank登录号分别为:AY771807,AY771808,AY771809,AY771810)。DNA序列测定和分析表明,绵羊子宫平滑肌CaP h1cDNA全长1499bp,编码297个氨基酸,5′UTR及3′UTR分别为79bp和529bp。CaPh1基因组DNA的克隆和序列分析表明,绵羊CaP全长约8kb,由7个外显子和6个内含子组成。同源序列比较发现,该基因外显子在不同物种间相对保守;与人类、野猪、小鼠、大鼠和鸡CalponinmRNA同源性分别为88%、92%、81%、79%和81%,但不同物种间内含子存在较大差异(>50%)。填补了绵羊CaP基因分子克隆的空白,为进一步研究该基因的功能及子宫平滑肌收缩的调节机理奠定了基础。

小鼠SmX5基因mRNA的选择性剪接(英文)

通过RT PCR技术 ,发现小鼠SmX5基因的另外 3种选择性剪接体 ,分别命名为SmX5a、b和c。小鼠SmX5acDNA具有完整的内含子 1,而SmX5bcDNA含有部分内含子 2。SmX5c的保留片断和SmX5b在相同位置起始 ,但保留部分延伸经过余下的内含子 2。余下的DNA序列在所有内含子 外显子边界处都符合剪接的“GT AG”规则。RT PCR的表达分析显示这 3种异构体都是稳定的转录产物 ,均通过剪接体特异性引物的PCR反应在mRNA水平上得到证实。和SmX5相比较 ,剪接体的出现频率都很低。RT PCR表达分析提示 ,SmX5和它的 3种异构体存在于小鼠的脑、肾、睾丸、胸腺、肝、脾和心脏。SmX5a主要在胸腺中表达 ,而SmX5b和c在所有组织都可以检测到。SmX5不同选择剪接体及其组织特异的不同剪接方式的存在 ,表明SmX5的表达是复杂的 ,并且所有 4种SmX5mR

绵羊特异新基因OaN2片段的克隆及融合表达

为制备绵羊MHC区段1个新基因(OaN2)的特异性抗体及其表达模式和功能研究奠定基础,克隆OaN2的1个特殊片段(OaN2F,Genbank登录号:GQ244478)并做融合表达。以反转录得到的中国美利奴细毛羊的第一链cDNA为模板进行PCR扩增,并利用扩增产物构建重组质粒,转化感受态大肠杆菌DH5α后诱导表达得到OaN2F和GST(谷胱甘肽S转移酶)的融合蛋白GST-OaN2F,将其纯化后鉴定。结果表明,成功克隆到了OaN2F(111bp)片段,并得到了纯化的30kD的GST-OaN2F融合蛋白。

尖锐湿疣样本中HPV病毒的分子检测

调查男性和女性尖锐湿疣样本中人乳头瘤病毒(HPV)的检出率及病毒类型,为研发相关防治疫苗提供依据,以HPV外壳蛋白DNA序列为模板设计特异引物,SSP-PCR扩增检测样本中HPV的感染率和病毒类型。收集了北京及邯郸市医院门诊尖锐湿疣样本22例,其中男性13例,女性9例。检测发现所有样本中存在着高浓度的HPV病毒DNA。男性样本中有5例感染HPV6型,6例感染HPV11型,2例为HPV6+HPV11混合感染。女性样本中有3例感染HPV6型,2例感染HPV11型,4例为HPV6+HPV11混合感染。被诊断为宫颈湿疣的4位女性还在其含宫颈黏膜脱落细胞的样本中检出了HPV16、HPV18、HPV33、HPV35、HPV45、HPV54、HPV56或HPV58等高危险型病毒类型。所有检测到的HPV病毒DNA片段均TA克隆并将测定的DNA序列存入了国际基因数据库GenBank(DQ003066-DQ003079)。调查没有在单纯的男女尖锐湿疣组织块中检测到除HPV6和HPV11以外的其他HPV类型。该研究建立了灵敏可靠的HPV分子检测及分型方法,尖锐湿疣中HPV的检出率达100%。研究初步结果显示导致男女尖锐湿疣的HPV病毒类型没有显著差异,主要为HPV6及HPV11型。