生果、蔬中大肠杆菌O157∶H7荧光定量PCR检测方法的评估及改进

目的:评估污染风险较高的6种生果、蔬中E.coli.O157:H7的PCR检测情况,以及初步探讨其机理和改善措施。方法:采用添加标准菌株,比较荧光定量PCR检测方法和传统分离培养法的检出情况,然后在PCR反应体系中分别添加PVPP、脱脂奶粉、BSA等物质,比较检出灵敏度的改善情况。结果:除绿豆芽和青椒外,PCR检测方法和传统分离培养法均能在1 cfu/10g、10 cfu/10g、100 cfu/10g的接种浓度上检出阳性,对于绿豆芽和青椒,荧光定量PCR检测方法在1 cfu/10g接种浓度上未检出,分离培养法在10 cfu/10g、100 cfu/10g两个接种浓度上均未检出。添加脱脂奶粉和BSA后,绿豆芽和青椒样品在1 cfu/10g的接种浓度上检出阳性,且在该浓度上其他样品的检出频率均有一定提高。PVPP对PCR体系改善不明显。结论:在生果、蔬中E.coli.O157∶H7检测中,荧光定量PCR检测方法比传统分离培养法灵敏度更高。脱脂奶粉和BSA可以用于改善生果、蔬中E.coli.O157:H7的荧光定量PCR检测体系,提高检出率和检测灵敏度。

进口冻肉中小肠结肠炎耶尔森氏菌检出情况分析

目的:了解我国进口冻肉产品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检出情况,为此类产品的风险分析和检验检疫工作提供依据。方法:通过采用小肠结肠炎耶尔森氏菌的国标检验方法和VITEK、API生化鉴定仪对247份进口冻肉产品进行检测。结果:247份样品中共检出耶尔森属菌33份,其中17份为小肠结肠炎耶尔森氏菌,检出率为6.88%,均属于生物1A型,其中3株为血清O:8型,其余均属非常见血清型。阳性样品中16份为冻鸡类样品,1份为冻猪肉类样品。94份海产样品无一份检出。结论:通过实验数据分析我国进口的冻肉产品中冻鸡类产品检出小肠结肠炎耶尔森氏菌比率较高,而海产品和冻猪肉产品中检出率相对较低,所以认为冻鸡类产品小肠结肠炎耶尔森氏菌污染风险较高,应加强此类产品检验监管力度。

进出口食品中肠炎沙门氏菌的脉冲场凝胶电泳分子分型分析

目的:分析近年深圳市进出口食品中分离的肠炎沙门氏菌菌株之间的相关性,初步建立食源性肠炎沙门氏菌脉冲场凝胶电泳分子分型数据库。方法:58株肠炎沙门氏菌菌株基因组DNA经XbaⅠ酶切,通过脉冲场凝胶电泳获得电泳图谱,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。结果:建立了深圳进出口食品中肠炎沙门氏菌DNA指纹图谱数据库。58株肠炎沙门氏菌分属18种脉冲场凝胶电泳图谱。聚类分析显示,58株肠炎沙门氏菌包含2个群,第1群主要为分离自美国进口禽肉的17株肠炎沙门氏菌,其相似性为91.45%,优势条带型为P2。第2群主要为分离自中国食品的36株肠炎沙门氏菌和分离自阿根廷的2株肠炎沙门氏菌,P8为优势条带型,相似性达到91.03%。结论:进出口食品中分离的肠炎沙门氏菌存在遗传谱系紧密相关的两个流行克隆群。

呋喃唑酮代谢物荧光纳米颗粒免疫层析法的建立

研究将荧光纳米颗粒与呋喃唑酮代谢物单克隆抗体共价耦联在一起,以竞争法作为反应模式来制备呋喃唑酮代谢物免疫层析试纸条。所制备的免疫层析试纸条仅与呋喃唑酮代谢物AOZ有交叉反应,而与非目标检测物之间无交叉反应,其灵敏性达1.0ng/mL,可满足相关检测标准要求。并且通过肉眼观察检测线和质控线之间的亮度,还可对AOZ进行半定量检测。该试纸条可用于食品中呋喃唑酮代谢物的检测。

E.coli O157:H7 LAMP检测方法的建立

目的建立检测E.coli O157:H7环介导的等温扩增方法(LAMP)。方法选取E.coli O157:H7的rfbE基因设计LAMP引物,优化建立LAMP检测体系。并用该体系和国标法对76份人工污染样品进行了检测。结果所建立的E.coli O157:H7 LAMP体系具有良好的特异性,用该体系对9属13种41株菌进行检测,结果只有E.coli O157:H7的扩增产物电泳结果为阶梯状条带,非E.coli O157:H7均未产生扩增产物,灵敏性为2.7×101CFU/mL。样品及培养基对反应体系没有影响或影响很小。对76份样品进行了检测,E.coli O157:H7 LAMP检测方法与国标法的总符合率为96.1%,2h内即可完成检测。结论本研究建立的E.coli O157:H7的LAMP法不但解决了分子生物学检测对实验室仪器设备的高要求问题,而且检测方法简便、快捷,非常便于基层实验室和现场检测使用。

O139群霍乱弧菌荧光纳米颗粒试纸条的研制

目的本研究旨在建立一种准确、快速、简便的O139群霍乱弧菌检测方法。方法以荧光纳米颗粒为标记物,采用双抗体夹心法模式制备O139群霍乱弧菌免疫层析检测试纸条。在紫外灯下观察试纸条上质控线和检测线上的荧光信号强度作为结果判定依据。结果用所制备的O139群霍乱弧菌荧光纳米颗粒检测试纸条对9属20种105株菌进行检测,所有20株O139群霍乱弧菌检测结果呈阳性,其余85株非O139群霍乱弧菌均呈阴性反应;用该试纸条检测人工污染的海鱼样品,灵敏性为3.5×104CFU/mL。用自制试纸条和标准法同时检测77份样品(均为水产品),两种方法的总符合率为85.7%。结论O139群霍乱弧菌荧光纳米颗粒检测试纸条的研制成功为O139群霍乱弧菌的快速检测提供了一个极好的检测方法,便于野外检测的开展,具有广阔的应用前景。

氯霉素荧光纳米颗粒免疫层析法的建立

本研究将荧光纳米颗粒与氯霉素单克隆抗体共价偶联在一起,用该颗粒代替常用的金标颗粒标记氯霉素单克隆抗体,以竞争法作为反应模式来制备免疫层析试纸条。在紫外灯下观察免疫层析试纸条上经免疫反应而产生的质控线和检测线上的荧光信号,利用荧光强度来半定量检测动物源性食品中的氯霉素残留。所制备的检测氯霉素的免疫层析试纸条只与氯霉素有交叉反应,与非目标检测物之间没有交叉反应。该试纸条的肉眼检测灵敏性为0.5ng/mL,满足相关检测标准要求。通过比较检测线和质控线之间的亮度,能够对氯霉素进行半定量检测。本研究建立的用于氯霉素残留检测的免疫层析法,具有简便、快速、灵敏度高的特点,有广阔的应用前景。

大肠杆菌O157：H7荧光纳米颗粒试纸条的研制

建立大肠杆菌O157：H7荧光纳米颗粒免疫层析法。方法：首先将荧光纳米颗粒与大肠杆菌O157：H7单抗共价偶联，制成大肠杆菌O157：H7单抗-荧光纳米颗粒偶联物。用该偶联物代替金标颗粒，以双抗体夹心作为反应模式来制备大肠杆菌O157：H7免疫层析试纸条。在紫外灯下观察免疫层析试纸条上经免疫反应而产生的质控线和检测线上的荧光信号，并利用荧光强度来半定量检测大肠杆菌O157：H7。结果：用所制备的试纸条对11属24种54株菌进行检测，所有27株大肠杆菌O157：H7的检测结果呈阳性．其它非大肠杆菌O157菌株检测结果呈阴性。用该试纸条检测人工污染的鸡肉样品。灵敏度为2．7×10^4CFU／mL。通过观察检测线的有无。可对大肠杆菌O157：H7进行半定量检测。分别用所制备的大肠杆菌O157：H7免疫层析试纸条和标准法检测57份样品，2种方法的总符合率为80．7％。结论：大肠杆菌O157：H7荧光纳米颗粒检测试纸条的研制成功，为大肠杆菌O157：H7的快速检测提供了一个极好的检测方法．便于野外检测的开展．具有广阔的应用前景。

胶体金免疫层析法快速测定生鲜牛奶中青霉素酶活性关键点分析

青霉素酶能催化水解青霉素类β-内酰环产生青霉噻唑酸,又称β-内酰胺酶。"无抗奶"一直是商家、消费者及检验机构所关注的对象,但很多"无抗奶"并非真的无抗生素残留的牛奶,而是使用青霉素酶等促使牛奶中的抗生素分解,而无法检出牛奶中原有的抗生素。本文对Peni-ase Sensor胶体金免疫层析法试剂盒快速测定生鲜牛奶中青霉素酶的方法进行了研究,并对其关键点进行了分析。

SPR生物传感器高通量检测多种食源性致病菌的研究

目的建立一种基于表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance technology,SPR)原理的生物传感器方法 ,实现11种常见致病菌的高通量检测。方法用表面自组装技术(self-assembled monolayer,SAM)在金膜表面引入羧基,然后通过氨-羧基反应将5’端标记有氨基的探针固定在芯片表面,经多重PCR扩增出的产物变性、杂交、生物素-亲和素系统信号放大等步骤完成目的片段的检测。对所建立的多重PCR-SPR检测方法的灵敏性、特异性等技术指标进行评价。结果本研究建立的多重PCR-SPR检测方法具有良好的灵敏性,该芯片检测11种常见致病菌的灵敏性均达到103~104cfu/m L,能满足现有检测要求。通过对实验室保存的14株标准菌株和沙门氏菌等90份样品分离株进行检测,结果显示该检测方法具有较好的特异性,无交叉反应。结论 本研究建立的多重PCR-SPR检测系统具有良好的灵敏性和特异性,完全适用于11种致病菌的高通量检测。该检测方法检测时间短、检测成本低、减少了人为因素的影响,具有良好的应用前景。

液相芯片技术在食品安全领域的研究进展

液相芯片技术(liquid chip technology)又称为灵活的多组分析(flexible multi-analyte profiling,x MAP)技术,是利用偶联特异性探针的荧光编码微球捕获待测核酸或蛋白后,逐一、快速地通过流式细胞仪双色激光探测区,进行定性或定量检测。我国将液相芯片技术应用在食品安全领域仍处于起步阶段,主要集中在食源性致病菌、转基因食品和农兽药残留等食品安全检测方面。液相芯片技术同时检测多种待测分子,具有高通量、快速、准确、所需样品量少、检测范围宽、可自由组合检测项目等优点。本文检索了国内外的文献,简要概述液相芯片技术的发展历史和基本原理,并介绍该技术及其商品化试剂盒在食品安全和其他领域上的研究应用,最后对液相芯片技术的发展前景做出展望。

GB 29921-2021《食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量》浅析

GB 29921-2021《食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量》已实施一年多,新标准整合了分散在不同食品标准中的致病菌限量规定,修改了标准名称、适用范围、应用原则,增加了食品类别,对控制食品中致病菌污染,预防微生物性食源性疾病发生具有重要的意义。本文通过与国内外相关标准的比较,对《食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量》(GB29921-2021)的适用范围、采样方案进行了分析,重点归纳分析了6种致病菌限量指标的变化及其特点,并提出了相关建议。

西加毒素细胞毒性检测方法的建立

小鼠神经母细胞瘤细胞经体外培养后,加入不同剂量的太平洋西加毒素(Pacific ciguatoxin-1,P-CTX-1)、箭毒苷和藜芦定,在不同时间点终止培养,以四甲基偶氮唑蓝(MTT)标定活细胞量,分析西加毒素剂量与细胞活性之间的线性关系。结果发现,细胞与毒素作用不同时间,西加毒素剂量(x)与光密度值(y)之间的线性关系呈现差异。在10 h、15 h及20 h等不同时间,其线性方程分别为y=-0.082 6x+0.923 0(R2=0.978 9)、y=-0.044 3x+0.601 5(R2=0.962 1)、y=-0.020 4x+0.323 7(R2=0.928 1)。以10 h的检测效率最高及检测结果最准确,因此将其定为最佳检测时间。细胞病变观察也证实了以上结果。

2019-2022年深圳口岸进出口食品中沙门氏菌的血清分型与耐药情况分析

目的了解2019—2022年深圳口岸进出口食品中检出沙门氏菌的血清分型与耐药情况。方法选用27株于2019年至2022年深圳口岸海关进出口食品中检出的沙门氏菌进行抗原血清鉴别与药敏分析。结果2019—2022年深圳进出口检出沙门氏菌的食品中无明显优势血清,但水产品中的沙门氏菌优势血清为韦太夫雷登。在进口食品中有数种国内罕见的血清型,但仍在常见的O群中。用美国临床和实验室标准化协会标准和欧洲药敏试验委员会标准对于沙门氏菌或肠杆菌科流行病学折点进行比较判堢,喹诺酮类对大多数菌株有一堢的作用,大多数菌株对叶酸代谢途径抑制剂敏感。多种耐药因子的出现使得沙门氏菌对药物的敏感性不断下降,出现对各大类抗生素多重耐药的“超级”菌,只有少数几种抗菌药物仍对大多数菌株有效。结论深圳进出口与本地近年检出的沙门氏菌无明显优势血清,但耐药性不断增强。沙门氏菌耐药性与年份和进出口原产地相关,与血清型无明显关系。

基于免疫磁分离的7种产志贺毒素大肠埃希氏菌快速检测方法的评价

目的评价基于免疫磁分离(immunomagnetic separation,IMS)的7种产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)快速检测方法的灵敏度与特异性。方法将大肠埃希氏菌O157:H7和大肠埃希氏菌O103不同稀释度的菌悬液用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2和黏附基因eae以及O157:H7和O103的抗原基因。同时,对菌悬液进行活菌计数,进行灵敏度研究。对8株携带stx1、stx2、eae基因的目标菌菌悬液和25株非目标菌的标准菌株及分离菌株的菌悬液用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2和黏附基因eae以及抗原基因,进行特异性研究。结果本方法检测大肠埃希氏菌O157:H7的stx1、stx2、eae以及抗原基因的灵敏度为10^(2)CFU/mL,检测大肠埃希氏菌O103抗原基因的灵敏度为10^(3) CFU/mL。8株目标菌检测结果与其携带的基因一致,没有假阴性,包容性达到100%。25株非目标菌检测结果与其携带的基因一致,未发现有假阳性,排他性达到100%。结论该方法具有良好的灵敏性及特异性,适用于食品中7种产志贺毒素大肠埃希氏菌的快速检测。

不同接种方式对食品中热损伤大肠菌群检测的比较研究

目的比较不同接种方式对食品中热损伤大肠菌群检测的影响。方法采用平板计数法、最大或然数法(most probable number,MPN)、表面涂布法、3M Petrifilm^(TM)大肠菌群测试片法、TSA+VRBG计数法等不同的接种方式对热处理食品中受损大肠菌群的检测进行了比较研究。结果平板计数法的结果均为<10 CFU/g,MPN法的结果在150~460 MPN/g之间。表面涂布法、3M Petrifilm^(TM)大肠菌群测试片法、TSA+VRBG计数法的结果对数均值和标准差分别为(2.26±0.032)、(2.31±0.026)、(1.82±0.068)。统计分析发现,表面涂布法、3M Petrifilm^(TM)大肠菌群测试片法的检测结果均高于TSA+VRBG计数法,且具有极显著性意义(P<0.01),而3M Petrifilm^(TM)大肠菌群测试片法的检测结果又显著高于表面涂布法(P<0.05)。结论 MPN法、表面涂布法、3M Petrifilm^(TM)大肠菌群测试片法、TSA+VRBG计数法均适用于热损伤大肠菌群的检测,其中表面涂布法,特别是3M Petrifilm^(TM)大肠菌群测试片法操作简便,且复苏热损伤大肠菌群的效果好。

2种微孔板试剂盒测定奶粉中3种水溶性维生素的对比研究

目的采用微板试剂盒A和进口微板试剂盒B测定奶粉中生物素、叶酸和维生素B123种水溶性维生素的含量,并进行对比研究。方法通过绘制标准曲线、准确性实验、重复性实验及加标回收实验对2个品牌维生素检测试剂盒进行评价。结果2个品牌试剂盒的相关系数均在0.99以上。试剂盒A和试剂盒B的生物素、叶酸及维生素B12的样品检测结果间的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为0.08%~7.25%、0.43%~9.25%和0.70%~13.91%;试剂盒A的精密度和回收率分别为1.97%~9.26%和73.67%~110.48%;试剂盒B的精密度和回收率分别为1.17%~5.40%和72.67%~120.00%。结论2种试剂盒的性能均满足检测要求,试剂盒A操作较简便,可替代进口微孔板试剂盒,用于奶粉中生物素、叶酸、维生素B123种水溶性维生素的测定。

干燥型荧光PCR试剂盒检测食源性致病菌研究

目的研究干燥型荧光PCR试剂盒检测副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌3种食源性致病菌的灵敏度、特异性和检测人工污染样品情况。方法目标菌和非目标菌接种至血平板, 36℃培养过夜,目标菌比浊至0.5 McF(麦氏单位), 10倍连续稀释后提取DNA,进行灵敏度研究;非目标菌直接提取DNA后检测,进行特异性研究;用高、中、低3个浓度目标菌液人工污染食品样品,按国标方法培养后用干燥型荧光PCR试剂盒检测。结果副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌的最低检测浓度分别为140、380和7900 CFU/mL。3种目标菌人工污染食品样品的最低检测浓度分别为1.2 CFU/25 g、5.1CFU/25 g、10 CFU/25 g。每种试剂盒仅对目标菌株的检测结果呈阳性,非目标菌株均呈阴性。结论新型干燥型荧光PCR检测试剂盒具有较好的灵敏度和良好的特异性,适用于食品中副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌的检测。

不同品牌CN琼脂上铜绿假单胞菌色素表达的研究

目的对铜绿假单胞菌在不同品牌CN琼脂上的色素表达及其原因进行研究。方法比较ATCC10145、ATCC 15442、CMCC 10104 3种铜绿假单胞菌标准菌株在5种不同品牌CN琼脂上的色素表达,并测定CN琼脂的磷含量。结果 5种CN琼脂的磷含量在123～1560mg/kg之间,最高的磷含量与最低磷含量相差10余倍。只产青脓素的铜绿假单胞菌ATCC 15442在各CN琼脂上均为黄色菌落,在紫外线下产荧光。只产绿脓菌素的铜绿假单胞菌ATCC10145,在含磷量低的CN琼脂上呈现为蓝色菌落,表现为产绿脓菌素;而随着磷含量的增加,CN琼脂上绿脓菌素的表达逐渐减弱。既产绿脓菌素又产青脓素的铜绿假单胞菌CMCC10104在含磷量低的CN琼脂上呈现为蓝色菌落,表现为产绿脓菌素;而随着磷含量的增加, CN琼脂上绿脓菌素的表达逐渐减弱,青脓素的表达逐渐增强,菌落颜色逐渐变黄并在紫外线下产荧光。结论铜绿假单胞菌在5种不同品牌的CN琼脂上的表达色素的情况与CN琼脂的磷含量有关, CN琼脂含磷量越低,越有利于绿脓菌素的表达,青脓素的表达受到抑制; CN琼脂含磷量越高,越有利于青脓素的表达,绿脓菌素的表达受到抑制。

水中产气荚膜梭菌在不同过滤培养体系中的表型特征的研究

目的比较水中的产气荚膜梭菌在2种不同孔径滤膜和2种培养基上的计数结果,并探讨其机理。方法用0.22μm和0.45μm 2种不同孔径的滤膜过滤添加产气荚膜梭菌的矿泉水后,将滤膜贴在亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂培养基(sulfite-polymyxin-sulfadiazine agar,SPS)和胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基(tryptose sulfite cycloserine agar,TSC)上,36℃±1℃厌氧培养24 h,观察菌落形态并进行菌落计数。用扫描电镜观察0.22μm和0.45μm2种滤膜表面的开口大小。结果水样经过2种不同孔径的滤膜过滤后,产气荚膜梭菌在TSC和SPS上的计数结果无显著性差异(P>0.05)。但与SPS相比,产气荚膜梭菌在TSC上更易形成特征性黑色菌落;与孔径为0.22μm滤膜相比,在孔径为0.45μm滤膜上生长的菌落更大。电镜扫描发现,0.22μm滤膜和0.45μm滤膜的平均表面开口分别为25μm、40μm,后者的表面开口更大。结论水样通过0.45μm孔径滤膜过滤,贴在TSC琼脂上培养,更适用于矿泉水中产气荚膜梭菌的检验。