小鼠血浆中黄卡瓦胡椒素B的HPLC-MS/MS定量分析方法建立与药代动力学特征研究

目的 建立小鼠血浆中黄卡瓦胡椒素B的高效液相色谱-质谱联用(HPLC/MS-MS)定量分析方法,并研究其在小鼠体内的药代动力学特征。方法 KM小鼠采用尾静脉注射(20 mg/kg)、腹腔注射(20、40和60 mg/kg)和灌胃(200、400和600 mg/kg)给药后,在0、5、30 min及1、2、4、6、8、12、16和24 h眼底静脉丛取血,分离血浆样品,HPLC-MS/MS分析样品中黄卡瓦胡椒素B的浓度,计算药代动力学参数,并评价不同途径给药下黄卡瓦胡椒素B的生物利用度。结果 在0.2~800.0 ng/mL浓度范围内,黄卡瓦胡椒素B线性关系良好(r=0.9995),定量下限为0.2 ng/mL,准确度在-8.50%~12.50%,精密度在1.73%~12.03%,且无明显基质效应(88.68%~102.04%),确证该方法适用于小鼠血浆中黄卡瓦胡椒素B的定量分析。药代动力学结果显示,黄卡瓦胡椒素B腹腔注射和灌胃给药后在体内吸收迅速,血药浓度在给药0.083 h即为峰值,在腹腔注射20~60 mg/kg和灌胃200~600 mg/kg给药范围内呈现良好的线性药代动力学过程。黄卡瓦胡椒素B的绝对生物利用度腹腔注射给药为53.29%,灌胃给药为1.38%。结论 本研究建立的HPLC-MS/MS定量分析方法,操作简便、准确、灵敏度高,成功应用于小鼠血浆中黄卡瓦胡椒素B的药代动力学特征研究。

孕激素诱导cyclin G1在小鼠子宫内膜上皮细胞的表达及其对细胞增殖的影响

本文在体外培养条件下研究卵巢激素诱导小鼠子宫内膜上皮细胞cyclin G1的表达及细胞增殖和细胞周期进程的变化,以探讨孕激素依赖的细胞周期调控因子cyclin G1对子宫内膜上皮细胞增殖的负调控作用。原代培养小鼠子宫内膜上皮细胞,待其生长汇合后分为4组:对照组(C组)、雌激素组(E组)、孕激素组(P组)、雌、孕激素共同作用组(EP组)。加入相应激素作用24h后,用细胞免疫化学方法检测各组细胞cyclin G1的表达水平;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞活力,间接观察子宫内膜上皮细胞的增殖情况;用流式细胞仪检测分布在细胞周期各时相的子宫内膜上皮细胞所占百分数。细胞免疫化学结果显示,cyclin G1在C组和E组子宫内膜上皮细胞上无明显表达,而在P组和EP组子宫内膜上皮细胞中表达明显,且定位于细胞核内。MTT法结果显示,与C组相比,E组细胞活力明显增高,而P组和EP组的细胞活力均明显下降,表明雌激素能促进子宫内膜上皮细胞增殖,而孕激素则具有抑制子宫内膜上皮细胞增殖的作用。流式细胞术检测显示,与C组相比,E组中处于S期的子宫内膜上皮细胞百分数增多;P组与EP组中处于S期的子宫内膜上皮细胞百分数明显减少,而处于G1期的细胞百分数和G2/M期的细胞百分数则明显增加。上述结果提示,孕激素依赖的cyclin G1可能通过阻滞细胞周期进程来参与孕激素对子宫内膜上皮细胞增殖的负调控作用。

浙贝母大鼠血清药物化学的质谱分析

目的为明确浙贝母药物吸收入血的有效物质,对浙贝母进行中药血清药物化学研究。方法建立浙贝母相关生物碱成分的液相-离子肼质谱联用(LC-TRAP-MS)检测方法,通过比较浙贝母药材、含药血清的LC-MS指纹图,确定浙贝母给药后吸收入血的药物成分。结果检测到9个已知成分,其中6种药物成分被吸收入血,分别为贝母素甲、贝母素乙、贝母辛、异贝母素甲、去氢鄂贝啶碱、puqiedinone。结论 6个入血药物成分是浙贝母在体内的直接作用物质,为阐明中药浙贝母的体内药效物质基础提供实验基础。

黄芪注射液对两种急性心衰模型的强心作用比较

目的:观察比较黄芪注射液和经典洋地黄类强心药去乙酰毛花苷注射液对戊巴比妥钠和心得安所致不同大鼠急性心衰模型的强心作用。方法:48只健康Wistar大鼠随机分为戊巴比妥钠模型组、戊巴比妥钠模型去乙酰毛花苷组、戊巴比妥钠模型黄芪注射液组、心得安模型组、心得安模型去乙酰毛花苷组和心得安模型黄芪注射液组,每组8只。分别于静脉输入戊巴比妥钠或心得安制作大鼠急性心衰模型,戊巴比妥钠模型去乙酰毛花苷组和心得安模型去乙酰毛花苷组在造模成功后均给予去乙酰毛花苷注射液(0.1 mg.kg-1),戊巴比妥钠模型黄芪注射液组和心得安模型黄芪注射液组在造模成功后均给予黄芪注射液(4 ml.kg-1),检测各组大鼠在造模成功并稳定20min后,静脉注射去乙酰毛花苷注射液或黄芪注射液5min、15min、30min、60min和120min各时间点LVSP、+dp/dtmax、HR等左室收缩功能的变化。结果:2种造模方法均能使大鼠LVSP、+dp/dtmax、HR显著降低,且在2h内保持在一个较低水平,显示大鼠急性心衰模型制作成功而稳定;静脉注射黄芪注射液使2种模型大鼠的LVSP、+dp/dtmax均显著升高,心得安模型大鼠黄芪注射液起效更为迅速,于药后5min即出现了明显的正性肌力作用(P<0.05);戊巴比妥钠模型大鼠药后15min才出现心肌收缩力的明显增强(P<0.05)。结论:与戊巴比妥钠所致急性心衰模型相比,心得安诱发的急性心衰模型更适合于黄芪注射液治疗急性心衰的药理药效学研究。

基于均匀设计的中药有效组分复方配伍研究

目的探索基于均匀设计的中药抗氧化有效组分复方的研究分析方法。方法采用均匀设计和改进最小角回归分析,对甘草总黄酮、银杏叶提取物、淫羊藿总黄酮和黄芪总苷组成的中药组分复方不同配比体外清除DPPH自由基的作用进行研究。结果通过分析获得了中药组分配伍清除DPPH的回归方程,优化组合后进行药效学验证,结果显示该中药组分配伍最佳剂量组合为甘草总黄酮0.8mg/ml、银杏叶提取物3.144mg/ml、淫羊藿总黄酮0.024mg/ml和黄芪总苷0.036mg/ml。结论上述中药组分配伍后能有效清除DPPH自由基;本实验采用的均匀设计结合改进最小角回归分析适合"非线性、小样本"生物实验数据数据分析,为筛选评价抗氧化中药有效组分复方提供了合适的研究方法。

利用磁珠法结合MALDI-TOF MS进行慢性心衰气阴虚证血液蛋白质组学研究的方法学探讨

目的:建立磁珠法结合MALDI-TOF MS进行慢性心衰气阴虚证血液蛋白质组学研究的实验方法。方法:采用MALDI-TOF-MS技术检测不同磁珠分离的患者血液蛋白质谱,从采集、蛋白提取、反复冻融、重复性、基质样品比例等方面分析其影响。结果:血清质谱峰均多于血浆,弱阳离子磁珠出峰数量优于铜螯合磁珠,气阴虚证患者与健康组比较蛋白表达有明显差异。结论:该方法作为一种高通量、快速分离、制备和鉴定的蛋白质组学技术,整个实验体系稳定、可靠、重复性好,适用于中医证候蛋白质组学的研究。

黄芪 水蛭对实验性脑缺血大鼠的改善作用研究

目的观察黄芪、水蛭对大鼠局灶性脑缺血引起的脑梗死的保护作用。方法大鼠按体质量均匀分为假手术对照组、模型对照组、黄芪、水蛭(9∶1,7∶1,5∶1)剂量组,预给药4d后采用线栓阻断大脑中动脉血供造成大鼠局灶性脑缺血模型(MCAO),观察黄芪、水蛭对脑缺血大鼠脑梗死比例以及凝血酶原时间(PT)的影响。结果与模型对照组比较,黄芪、水蛭组可不同程度降低局灶性脑缺血大鼠脑梗死面积(P<0.01,P<0.05),并能明显延长PT时间。结论黄芪、水蛭可明显降低大鼠脑缺血梗死率。

加味归脾汤对乳腺癌MDA-MB-435株抑制作用的研究

目的:研究加味归脾汤对人类乳腺癌细胞的抑制效果及原理。方法:不同浓度加味归脾汤作用MDA-MB-435细胞,阳性对照药为Docetaxel,通过MTS、细胞凋亡分析和Caspase-8检测等评价药物的抑制效果。结果:加味归脾汤高浓度组的抑制率在48 h时高于Docetaxel,72 h时与Docetaxel相同。流式细胞仪72 h检测结果显示,加味归脾汤高浓度组和Docetaxel总凋亡程度相近。Caspase-8表达量检测显示,加味归脾汤高浓度组在48 h、72 h时均高于Docetaxel。结论:加味归脾汤高浓度组的抑制效果可以达到或超过Docetaxel,其抑制作用可能是通过Caspase途径起效。

高效液相色谱串联质谱分析吴茱萸水煎液的化学成分

目的建立吴茱萸中化学成分的液质联用分析方法,研究吴茱萸的化学成分。方法水煎煮提取吴茱萸,运用LC-MSn联用技术得到各化合物的总离子流图和多级质谱图,从而对各色谱峰进行鉴定。结果从吴茱萸提取物中鉴定出14个化合物。结论 HPLC-MSn法可用于吴茱萸中3类成分的结构分析,为建立准确的质量评价方法提供了参考。

不同衰老大鼠模型大脑皮层细胞凋亡状况的比较

目的比较不同方法建立的衰老大鼠模型大脑皮层细胞凋亡与线粒体膜电位的变化状况。方法实验分为正常对照组、单纯腹腔注射D-半乳糖组、单纯摘除胸腺组、D-半乳糖注射联合胸腺摘除组、维生素E、C治疗组。造模及投药6w后,检测血清超氧化物歧化酶(SOD)水平和血清总抗氧化能力(T-AOC),并采用流式细胞术观察大脑皮层神经元细胞凋亡发生率以及神经元线粒体膜电位。结果造模及投药6w后,与对照组比较,3个造模组血清SOD水平和T-AOC均明显下降(P<0.05),造模3组之间无显著差异;神经元细胞凋亡发生率均明显上升,神经细胞线粒体膜电位均显著降低(P<0.05),以D-半乳糖腹腔注射联合胸腺摘除组尤为明显,与单一方法造模的两组比较该两项指标变化均有显著意义(P<0.05)。结论应用胸腺摘除复合D-半乳糖腹腔注射方法建立的衰老大鼠模型,更能体现出神经细胞衰老损伤的病理特征。

体外诱导C57BL/6小鼠CIK细胞研究

目的:诱导培养C57BL/6小鼠CIK细胞,并检测其对肿瘤细胞杀伤作用。方法:使用三种细胞因子及抗CD3单抗体外诱导C57BL/6小鼠脾细胞,用CCK-8试剂检测对肿瘤细胞杀伤作用。结果:培养出的CIK细胞主要为CD8+NK1.1+细胞,对肿瘤细胞有较强杀伤作用。结论:成功诱导出C57BL/6小鼠CIK细胞。

平贝母和给药平贝母后大鼠尿液内化学成分LC-MS^n分析

目的建立平贝母化学成分的液质联用分析方法,并以此快速指认大鼠给药平贝母后尿液内化学成分。方法运用LC-MSn联用技术得到贝母水煎液内各化合物的总离子流图和多级质谱图,结合同种类化合物标准品质谱裂解规律,从而对各色谱峰进行鉴定,并以此指认尿液内药源成分。结果从平贝母水煎液中鉴定出11个化合物,从大鼠给药平贝母尿液中鉴定出8种化合物。结论 HPLC-MSn法可用于平贝母中异甾体类生物碱的结构分析,并可用于快速推断给药平贝母后尿液内异甾体类生物碱成分,为建立准确的质量评价方法和生物样品快速指认提供了参考。

细胞周期蛋白G_1参与孕激素对子宫内膜基质细胞增殖作用的研究

目的在体外培养条件下,研究孕激素(P)对子宫内膜基质细胞(ESC)的增殖作用和细胞周期分布的影响及细胞周期蛋白G1(cyclin G1)的表达情况。方法分离小鼠ESC进行原代培养,采用四甲基氨唑蓝法(MTT)检测P处理后ESC的增殖情况,用流式细胞仪检测细胞周期各时相的分布,用细胞免疫化学技术检测cyclin G1蛋白的表达情况。结果孕激素对ESC起增殖作用,在一定范围内呈时间依赖性。孕激素作用12 h后,S期细胞百分数明显上调。雌激素(E)、孕激素(P)、雌激素+孕激素(EP)联合分别刺激ESC 24 h,P组和EP组的ESC增殖,S期的细胞百分数升高,且cyclin G1蛋白表达阳性。E组与空白对照组(C组)的ESC增殖抑制,S期的细胞百分数维持低水平,且cyclin G1蛋白表达阴性。结论孕激素对ESC起增殖作用,引起细胞周期重新分布可能是孕激素促ESC增殖的机制之一。cyclin G1呈孕激素依赖性表达,可能参与孕激素对ESC的促增殖作用。

流式微球分析法检测小檗碱对RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响

建立并优化了在FACSAriaⅠ流式细胞仪上应用流式微球分析法(CBA法)检测分泌型炎症细胞因子的方法。用CBA法检测小檗碱对经LPS诱导的小鼠RAW264.7细胞分泌IL-6I、L-10I、FN-γ、MCP-1、TNFI、L-12p70等细胞因子的影响。结果显示,小檗碱可显著抑制LPS诱导的各种炎症细胞因子的分泌,并呈良好的量效关系。12 mol/L的小檗碱对IL-10I、FN-、TNF及IL-12 p70的抑制率分别为5.10±0.24%、18.64±3.95%、22.59±0.56%、68.27±2.49%、48 mol/L的小檗碱抑制作用更显著,抑制率分别为45.62±1.51%、39.00±3.58%、79.61±5.17%9、2.03±0.85%。各细胞因子荧光值与其实际浓度具良好的线性关系,相关系数均在0.999以上。流式微球分析法是一种灵敏高效、节省成本、重复性好的检测方法,为肿瘤及免疫相关炎症因子的高通量检测提供了现实可行的方法。

藿莲香Ⅱ号复方的致突变性研究

目的根据《食品安全性毒理学评价程序和方法》(GB15193-2003)对中药复方藿莲香Ⅱ号进行相关的毒理学评价。方法应用急性毒性试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠骨髓细胞染色体畸变试验和Ames试验检测该复方的急性毒性和致突变性。结果急性经口毒性试验:雌性、雄性小鼠经口最大无毒浓度(MTD)为10g/kg体质量,属实际无毒;致突变实验:小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠骨髓细胞染色体畸变试验和Ames试验结果均为阴性,显示在本实验条件下,该配伍未见有致突变性作用。结论藿莲香Ⅱ号未见有致突变性作用。

抗人白蛋白单克隆抗体制备与尿微量白蛋白半定量金标试纸研制

目的制备抗人白蛋白单克隆抗体和尿微量白蛋白（microalbuminuria，MCA）半定量试纸，作MAC检测，与传统检测方法比较其灵敏度和特异性。方法在制备抗人白蛋白单克隆抗体的基础上，采用人白蛋白作为包被抗原，应用胶体金免疫层析技术竞争抑制法原理制备出人尿微量白蛋白半定量检测试纸。用所研制的试纸与市售尿白蛋白ELISA诊断试剂平行检测50例正常健康成人晨尿样品和56例临床样本。结果用所研制的试纸与ELISA诊断试纸二者符合率达100％。结论本研制试纸完全可以满足临床检测要求，且操作简单、灵敏度高、特异性强、稳定性好，具有广泛的应用前景及广阔的发展空间。

毛蚶抗癌蛋白主要组分的分离纯化及作用研究

目的:对毛蚶抗癌蛋白(ASAP)进行了分离纯化,并研究分离后毛蚶抗癌蛋白主要组分的抗癌作用。方法:依次利用阴离子交换层析、疏水作用层析、凝胶过滤层析对ASAP进行分离;联合p53基因表达激活及CCK-8细胞活力测定检测分离组分的抗癌活性;CCK-8细胞活力测定法检测毛蚶抗癌蛋白主要组分对人结直肠癌Colo205、HT-29、人肺癌A549、人慢性髓性白血病K562细胞活力的影响;Annexin-V/PI双染结合流式细胞术检测细胞凋亡;Western Blotting法检测细胞凋亡相关蛋白:Mcl-1、Bcl-2、Bax、procaspase-3的表达情况。结果:从ASAP中分离得到的毛蚶抗癌活性蛋白主要组分C6在24~72 h内对Colo205、HT-29、A549、K562的细胞活力均有不同程度的抑制作用,其中对Colo205细胞的抑制作用最明显,作用72 h时IC50为5.7μg/mL;C6可以诱导Colo205细胞凋亡且呈一定剂量依赖性;C6可以抑制抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2的表达,上调凋亡蛋白Bax的表达,引起凋亡蛋白caspase-3前体procaspase-3下降。结论:毛蚶抗癌蛋白主要组分C6对人多种癌细胞活力具有抑制作用,可诱导人结直肠癌Colo205细胞发生caspase通路依赖的细胞凋亡。

基于阴火论探析糖尿病及其慢性并发症

阴火是在脾胃气虚的基础上继发的邪火。糖尿病的发病是由于脾胃气虚日久,元气不足,血中伏火,消灼阴津所致,日久它脏受累,浊瘀酿毒,毒损络脉而形成诸慢性并发症。同时,阴火论可被视作是中医传统理论与现代医学糖尿病炎症发病学说沟通的桥梁,基于本论推导出的种种理论衍说已经当代证素学研究验证。东垣治消法可细分为甘温补中、甘寒泻火、升阳散火、活血化瘀通络、调畅情志等,当代医家运用本法治疗糖尿病及其慢性并发症多有验效。

补气中药治疗心衰新机制的研究——调节心肌能量代谢

以心肌能量代谢紊乱为切入点探讨中药特别是补气中药治疗慢性心力衰竭的新思路。总结既往学术文献及研究结果,分析心衰与心肌能量代谢之间的关系及补气中药与能量代谢的关系。能量缺乏及能量代谢障碍是心衰的主要标志之一,是心衰发生、发展和恶化的重要因素。研究表明抑制脂肪酸代谢产能、增加葡萄糖代谢产能可以改善心脏功能。中医学"气"的概念很大程度上与现代医学中"能量"密切相关。党参黄芪等补气中药及其相关复方及/或有效成分在改善心衰、调节脂质和糖代谢供能方面显示了较好的效果。更重要的是,这些中药大都含有多糖,其代谢成单糖后可能成为心肌能量代谢的底物,从而发挥对心衰心肌的保护作用。以心肌能量代谢为切入点开展中药特别是补气中药治疗心衰的研究,将有可能找到改善心肌能量代谢障碍、改善心衰预后的新的药物作用途径,从而从一个新的视角进一步完善补气中药对心衰治疗作用的机制研究,同时也为中药治疗能量代谢紊乱相关疾病的机制研究提供一个新的研究思路。

基因编辑技术的研究进展及其在中药研究中的前景展望

基因编辑技术是一项对基因组进行精确定点修饰的技术,可对特定DNA片段进行敲除、加入和替换等,从而在基因组水平上进行精确的基因编辑。其技术本质均是利用非同源末端链接途径修复和同源重组修复,联合特异性DNA靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。基因编辑技术在科研、农业、医疗等领域都具有极其广泛的发展前景和应用价值。在疾病基因治疗领域,基因编辑技术在癌症如白血病、遗传性疾病如血友病、地中海贫血、多种肌肉营养障碍症和逆转录病毒相关传染病如艾滋病等疾病的治疗方面取得许多堪称跨时代的佳绩:结合基因编辑技术开展的实验新方法学研究及动物模型的制备工作也在迅猛地发展和完善;世界各地的实验室也已将基因编辑技术应用于预防疟疾、器官移植、生物制药、农业育种改良、灭绝物种复活等多个研究领域。该文就基因编辑技术在上述领域中的研究进展进行一些概括和总结。此外还归纳了一些当前针对基因编辑技术存在的争议和思考,并初步探讨了该技术在中药研究中的潜在应用前景。