种蛋中禽白血病病毒P27抗原检出率与鸡群禽白血病发病率的相关性研究

本研究旨在观察种鸡群所产种蛋中禽白血病病毒P27抗原检出率与种鸡群发病状况及其下一代鸡群禽白血病发病率的相关性,为鸡群净化和禽白血病预警提供参考依据。对国内海兰褐蛋鸡等品系不同祖代及父母代共7个种鸡场所产种蛋的P27抗原进行了检测,对部分种鸡场的ALV-A/B和ALV-J抗体进行了检测和病毒的分离鉴定,对各种鸡群孵化后下一代鸡群的禽白血病发病状况和客户投诉情况进行了追踪调查。7个种鸡场所产种蛋中P27抗原检出率为0%～12%,P27抗原检出率与种鸡群的发病状况及其子代鸡群的发病状况和客户投诉情况密切相关,即种蛋中P27抗原检出率越高,种鸡群发病情况越严重,下游客户鸡群发病率和投诉率越高。种鸡群的种蛋P27检出率与种鸡群及其孵化后鸡群的禽白血病感染状况具有较好的吻合性,可以作为开展ALV的流行病学调查和禽白血病感染风险评估的重要指标。

PCR结合斑点杂交技术在检测禽网状内皮增生病毒中的应用

为评价PCR结合斑点杂交技术在鸡REV检测中的应用价值,采用PCR法制备禽网状内皮细胞增生症病毒特异性地高辛标记DNA探针,同时用PCR技术、斑点杂交方法和PCR产物斑点杂交方法检测了不同地区的病、死鸡的组织样品REV的感染情况。结果表明,PCR产物斑点杂交法的检出率(45.16%,14/31)高于组织DNA直接斑点杂交法(32.26%,10/31),显著高于单纯PCR扩增法(0%,0/31)。PCR结合斑点杂交检测技术能快速、敏感、准确,充分避免PCR中的假阴性和假阳性现象,值得推广应用。

H7N9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在杆状病毒中的表达及其免疫效力评估

旨在利用杆状病毒表达系统构建1株对高致病性H7N9亚型禽流感病毒(A/Chicken/Huizhou/HZ-3/2016)攻击后的家禽提供保护的候选疫苗株。用同源重组的方法构建1株表达H7N9亚型禽流感病毒(A/chicken/Shaoxing/5201/2013株)血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的重组杆状病毒。用PCR技术鉴定重组杆状病毒rBac-SX5201HA的遗传稳定性,用间接免疫荧光方法和Western Blotting方法鉴定HA蛋白的表达情况,用血凝试验检测HA蛋白的体外活性,继而对重组疫苗在无特定病原体(Specific pathogen free,SPF)鸡上进行免疫效力试验,并对免疫后21 d的SPF鸡血清进行抗体检测,对攻毒5 d后的鸡咽喉和泄殖腔棉拭子进行病毒分离。结果显示,重组杆状病毒rBac-SX5201HA在昆虫细胞中生长良好,且可稳定高效表达H7 HA蛋白,血凝效价可达2^(6);重组疫苗免疫SPF鸡21 d后可诱导2^(8.4)血凝抑制(Hemagglutinin inhibition,HI)抗体效价并能抵抗高致病性H7N9亚型禽流感病毒的攻击,免疫组SPF鸡群均未发病或死亡,仅有17%的SPF鸡在攻毒后第5 d出现排毒。可以看出,重组疫苗对高致病性H7N9亚型禽流感病毒攻击后的SPF鸡提供了100%的保护,且可有效抑制病毒在SPF鸡体内的复制。

二株B亚群禽白血病病毒全基因组序列及其在细胞上的复制性比较

本研究比较了从山东地方品系鸡群分离到的二株B亚型禽白血病病毒(ALV)SDAU09E3和SDAU09C2的全基因组序列及它们在细胞培养上的复制动态。这二株ALV-B的同源性为95.4%,与GenBank中3株B亚群参考株之间的同源性也均在91.0%～94.9%间,而与其它亚群参考株的同源性均低于87.9%。与亚群无关的gag、pol基因和LTR的核苷酸序列比较表明,这二株ALV-Bgp85基因的gag和pol基因与所有比较的参考株的同源性均在93%以上。LTR与其他外源性ALV参考株的LTR间的同源性在72.6%～88.3%范围内,但与E亚群内源性ALV的LTR的同源性只有51.5%。然而,这二个ALV-B的LTR的同源性也只有74.8%,远低于其他基因组部分的同源性,特别是它们的LTR的U3区同源性只有68.8%,二者在二个CAAT分布上也显著不同。对这二株ALV-B在DF-1细胞上的复制动态比较表明,它们在细胞培养上清液中的TCID50值非常类似,但SDAU09E3株核衣壳蛋白p27抗原的含量显著高于SDAU09C2株。这表明,同一亚群的不同毒株在复制过程中,所表达的p27抗原量与所形成的具有传染性的病毒量间没有平行关系。这一差异与LTR-U3区的相关性则有待应用感染性克隆技术来做进一步深入研究。

猪繁殖与呼吸综合征病毒在抗体免疫选择压下的变异

为了确定抗体选择压对PRRSV不同基因变异的影响,将PRRSV野毒株SD0612分别在Marc-145细胞上做两个系列的连续传代,系列Ⅰ培养液中不添加抗SD0612血清,包括A,B,C3个平行的传代系;系列Ⅱ培养液中添加一定比例的抗SD0612血清,包括D,E,F3个平行的传代系.上述传代系连续传代40代,其中有抗体组40代突变株F40获得抗血清后按同样方法连续传代40代进行第二轮抗体选择压实验.各传代系每隔10代收获病毒并对其ORF3,ORF4和ORF5进行扩增、克隆和序列分析.SD0612及其两次传代中有抗体组40代毒突变株F40和e40接种猪后收获血清,进行3个毒株之间的交叉血清中和实验以测定其抗原相关性系数.序列分析显示,两次传代中有抗体组在ORF3,ORF4,ORF5的有义突变与无义突变比值(NS/S)分别为11.0和3.5,0.5和0.67,13.0和4.0;无抗体组NS/S比值则仅为0.33～1.40.有抗体组ORF5和ORF3分别有14和4个稳定的氨基酸突变位点,而这些位点在无抗体组未被发现.交叉血清中和实验结果显示,SD0612与有抗体组突变株F40和e40的抗原性相关系数分别为0.625和0.5.上述结果表明,抗体的选择压能够显著影响PRRSV的ORF5和ORF3的基因变异并能使其抗原性发生改变.

猪繁殖与呼吸综合征病毒准种多样性在抗体选择压下的演变

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒野毒株SD0612准种的多样性,将野毒株SD0612原始毒的细胞培养物提取RNA,并扩增和克隆其高度易变的ORF5基因选取所有阳性克隆子测序,并以DNAStar软件对序列进行分析,以ORF5序列的多样性来显示准种的多样性.结果显示,SD0612野毒株ORF5基因获得的60条序列的核酸同源性介于97.7%与100%之间,这种差异代表了不同准种的序列差异;60条核酸序列中17条序列完全相同,代表了在该种群中占主体的优势准种的序列.为研究PRRSV准种的这种多样性在抗体选择压下的演变规律,将SD0612株在Marc-145细胞上分别进行有抗SD0612抗体和无抗SD0612抗体两个系列的连续传代,每个传代系又包括3个平行的传代系列,连传40代后得到传代毒A40～F40.将有SD0612抗体传代系列的第40代毒F40作为新的起点按上述方法进行第二轮传代,连传40代后分别得到传代毒a40～f40.将两轮传代第40代病毒按针对原始毒的方法扩增其ORF5基因以进行准种多样性分析.结果显示,SD0612株在有抗体的两次连续传代中准种的多样性均在减少,其优势准种在种群中的比例在上升,而无抗体传代组优势准种在种群中的比例在下降.该研究显示,野毒株SD0612是由多个准种组成的种群,抗体的选择压能够显著减少PRRSV的准种多样性,并可能使某些准种演变为新的优势准种.