雷帕霉素对劳力型热射病大鼠下丘脑损伤的保护作用及其机制

目的探讨雷帕霉素(Rapa)对劳力型热射病大鼠下丘脑损伤的保护作用及其机制。方法80只Wistar雄性大鼠随机分为对照组、Rapa组、劳力型热射病(EHS)组及EHS+Rapa组,每组20只。Rapa组及EHS+Rapa组大鼠分别于建模前连续4 d腹腔注射Rapa(1 mg/kg,1次/d),对照组及EHS组给予同体积生理盐水。将EHS组及EHS+Rapa组大鼠置于温度(39.5±0.3)℃、湿度55%±5%的气候舱中跑步,建立EHS模型;对照组及Rapa组大鼠置于相同室温下,进行与EHS组同等强度的跑步。在模型建立过程中,观察各组大鼠的一般状态,测量核心温度并绘制大鼠生存曲线(n=11)。EHS组及EHS+Rapa组大鼠于入舱80 min后,从舱中取中,并观察300 min。对各组大鼠实施麻醉,取腹主动脉血及下丘脑等组织,HE及尼氏染色观察下丘脑的组织病理学改变;免疫荧光法测定神经元凋亡情况;Western blotting法检测大鼠下丘脑组织中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(pmTOR)、自噬效应蛋白(Beclin-1)、泛素结合蛋白(p62)及自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达,并计算pmTOR/mTOR及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中神经元特异性烯醇化酶(NSE)、脑活性肽100β蛋白(S100β)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平。结果在入舱后80 min时,与对照组相比,EHS组的核心温度明显升高;与Rapa组相比,EHS+Rapa组的核心温度明显升高(P<0.001)。与EHS组相比,EHS+Rapa组大鼠的生存率升高(P<0.01)。下丘脑组织HE及尼氏染色显示,EHS组大鼠下丘脑神经元病理损伤更重,而EHS+Rapa组大鼠下丘脑神经元病理损伤较EHS组明显减轻(P<0.001)。免疫荧光检测结果显示,EHS组大鼠下丘脑组织中细胞凋亡率较对照组显著增高,而与EHS组相比,EHS+Rapa组大鼠下丘脑组织中细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。Western blotting结果显示,与对照组相比,EHS组大鼠下丘脑组织中pmTOR/mTOR及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,Beclin-1表达增加,p62表达减少(P<0.01);与EHS组相比,EHS+Rapa组大鼠下丘脑组织中pmTOR/mTOR比值降低,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,Beclin-1的表达增加,p62表达减少(P<0.05)。ELISA结果显示,与对照组相比,EHS组血清中NSE、S100β、IL-6及TNF-α的表达水平均增高(P<0.05);与EHS组相比,EHS+Rapa组血清中NSE、S100β、IL-6及TNF-α表达水平均降低(P<0.05)。结论雷帕霉素可减轻劳力型热射病引起的下丘脑损伤,改善脑细胞功能,降低炎性因子水平,减少组织细胞凋亡,可能与其抑制mTOR信号通路、增强下丘脑的自噬水平有关。

激活Pink1/Parkin通路减轻劳力型热射病大鼠急性肺损伤

目的探讨PTEN诱导酶1(PTEN-induced putative kinase 1,Pink1)/帕金蛋白(parkin)通路在劳力型热射病(exertional heat stroke,EHS)大鼠急性肺损伤中的作用。方法将60只SD大鼠随机分为4组,正常组(CON组)、正常Parkin过表达组(CON+Parkin组)、劳力型热射病组(EHS组)和劳力型热射病Parkin过表达组(EHS+Parkin组),每组大鼠15只。正常Parkin过表达组和EHS Parkin过表达组大鼠经尾静脉注射携带有Parkin基因的腺相关病毒0.15μL。20 d后,建立EHS大鼠模型,绘制生存曲线。检测肺系数和肺毛细血管通透性;HE染色观察肺组织病理变化;ELISA方法检测肺组织中白介素(interleukin,IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)和活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的含量;免疫组织化学观察肺组织凋亡;Western blot方法测定大鼠肺组织中Pink1、Parkin、泛素结合蛋白P62(Ubiquitin-binding protein p62)和微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达,并计算LC3-II/LC3-I比值。免疫荧光检测Pink1和Parkin共定位。单因素多水平组比较采用单因素方差分析,采用SNK-q法进一步进行组间两两比较。结果与正常组相比,EHS组大鼠生存率降低(P<0.001),肺系数和肺血管通透性均升高[(4.39±0.42)、(33.38±8.29)μg/g,P<0.05)],肺组织发生渗出和实变,炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和ROS水平均显著升高[(34.31±5.34)pg/mL、(34.03±4.78)pg/mL、(91.64±8.16)pg/mL、(259.01±89.17)U/mg,P<0.05],细胞凋亡增加。Western及免疫荧光结果显示,劳力型热射病大鼠Pink1、Parkin表达减少,Pink1和Parkin结合减弱,LC3-II/LC3-I比值降低,P62表达增加。与EHS组相比,EHS Parkin过表达组的大鼠生存率明显升高(P<0.05),肺系数和肺血管通透性均降低[(3.83±0.62)、(22.49±7.90)μg/g,P<0.05],渗出和实变等病理改变明显减轻,上述炎症因子和ROS水平均显著降低[(14.09±3.24)pg/mL、(26.94±2.11)pg/mL、(63.35±11.62)pg/mL、(161.13±26.31)U/mg,P<0.05];肺组织凋亡减轻。肺组织中Parkin表达和LC3-II/LC3-I比值均升高(P<0.05),Pink1和Parkin的结合增强,P62表达减低(P<0.05),而Pink1表达差异无统计学意义(q=0.75)。正常组和正常Parkin过表达组之间差异无统计学意义(q=0.95)。结论激活Pink1/Parkin通路,增强线粒体自噬可减轻劳力型热射病大鼠急性肺损伤。