高表达Delta4增加Notch基因的表达

Notch信号传导系统在介导造血细胞增殖与分化过程中具有重要作用。通过分子克隆技术成功构建含标记基因FLAG的Notch配基Delta4的高表达载体pTracer CMV Delta4 FLAG ,瞬时转染COS7细胞 ,4 8h后收获细胞并制备融合蛋白 ,SDS PAGE凝胶电泳和Western blot证实后 ,将其稳定转染CHO细胞 ,Western blot鉴定并筛选高表达Delta4的Delta4 CHO1 4及Delta4 CHO1 5细胞株 ,利用Luciferase分析方法进行Delta4功能性研究。研究结果发现Delta4对Notch1及Notch2均具有信号功能活性 ,且对后者的活性功能水平大于前者 ,说明Delta4为Notch1及Notch2的配基。与其他配基功能比较 :对Notch1,Delta4的功能活性高于Delta1及Jagged1,但略低于Jagged2 ;对Notch2 ,Delta4的功能活性低于Delta1、Jagged1及Jagged2 ,但亦具有较强的活性水平。

氟化物遗传毒性的分子生物学研究进展

氟化物具有遗传毒性，本文对氟化物与核酸、蛋白、基因、细胞周期、致瘤性等间的关系，从分子生物学水平对氟化物的遗传毒性作了综述。

CA_(125)、CA_(19-9)检测在卵巢癌诊断及治疗中的价值

应用酶联免疫（ＥＬＩＳＡ）方法进行ＣＡ１２５、ＣＡ１９－９检测，结果显示ＣＡ１２５在卵巢癌术前患者中灵敏度为８７．５％，特异度为９０％，准确率为８８．７１％，明显高于其它疾病；卵巢癌术后ＣＡ１２５数值明显下降，与术前相比有显著性差异；ＣＡ１２５与ＣＡ１９－９联检可提高卵巢癌检出率。

双自杀基因慢病毒转移系统的建立及其对T淋巴细胞的体外杀伤作用

目的利用分子生物学方法构建CD和TK双自杀基因慢病毒转移载体。方法将慢病毒基因转移系统中的3种成分质粒(包膜质粒、包装质粒及目的基因转移质粒)用脂质体共转染入病毒包装细胞293T,荧光显微镜下观察;透射电镜下观察病毒颗粒;大量收集病毒上清,浓缩后用之感染T淋巴细胞,荧光显微镜下观察。结果荧光显微镜观察到对照组大量绿色荧光蛋白(GFP);透射电镜证实有大量病毒颗粒存在。单独使用前体药物5-氟脲嘧啶(5-FC)和/或无环鸟苷(GCV)后,细胞的存活率与未转染T淋巴细胞比较,差异显著(P<0.01),与单独使用5-FC或GCV比较,联合使用5-FC和GCV时T细胞的存活率明显降低(P<0.01)。结论慢病毒基因转移系统可使双自杀基因发挥强大的杀伤作用,为一种有效的基因转移系统。

氟化钠对人胚支气管上皮细胞肿瘤标志物的影响

目的探讨氟化钠(NaF)对人胚支气管上皮(HEBE)细胞肿瘤标志物改变的影响。方法无菌分离人胚支气管上皮细胞,传代培养,经不同浓度的NaF(0、1、2、4、6mmol/L)暴露36h,换液后继续培养36h,利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测NaF对HEBE细胞的毒性,同时收集培养液上清液,用酶联免疫分析方法(ELISA)检测癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、角质蛋白21鄄1(CYFRA21-1)、细胞角蛋白19(CK鄄19)等肺癌肿瘤标志物。结果NaF作用后细胞出现毒性反应,脱落皱缩,胞内颗粒增多,且有剂量依赖性,当NaF为6mmol/L时,吸光度(A)值仅为0.15±0.07,几乎无存活细胞;对照组及各NaF染毒组肺癌肿瘤标志物水平均较低,且差异无统计学意义。结论NaF可引起人胚支气管上皮细胞的细胞毒性,但尚未见其可引起肺癌肿瘤标志物的改变。

Ⅰ型粘蛋白单链抗体的制备及其生物学活性的初步研究

目的 :制备Ⅰ型粘蛋白 (MUC1 )基因工程单链抗体 (scFv) ,并对其生物学活性进行初步研究。方法 :提取纯化MUC1单链抗体原核表达质粒C31 ,使用酶切和PCR鉴定 ;采用HRP标记的抗ETag单克隆抗体进行Westernblot,筛选表达量高的菌落 ,大量扩增后 ,制备培养上清及胞周质中抗MUC1scFv;将MUC1高表达的SKOV3细胞铺于 96孔板 ,戊二醛固定后作为包被抗原 ,将制备的抗MUC1scFv抗体倍比稀释后利用ELISA方法检测其生物学活性。结果 :质粒C31经Sfil酶切后为 530 8bp,经Sfil、NotⅠ双酶切后为452 2bp和 786bp,PCR扩增片段为 1 0 75bp。Westernblot结果显示可溶性抗体为 30kD。选择表达量高的菌落 ,进行大量扩增、诱导表达、提取培养液上清及胞周质可溶性抗体 ,胞周质抗体水平明显高于培养液上清 ;利用SKOV3作为包被抗原进行ELISA ,当培养液上清1 :32、胞周质 1 :2时所测OD值最高。结论 :抗MUC1单链抗体表达于细菌的胞周质液和培养液上清 ,以胞周质液表达量最高 ;且制备的抗MUC1单链抗体有生物学活性。噬菌体表面呈现技术可大量制备人MUC1噬菌体基因工程单链抗体 。

山东省人巨细胞病毒感染的流行病学调查及其相关因素研究

目的:了解山东省人巨细胞病毒(humancytomegalovirus,HCMV)感染情况及其相关影响因素。方法:在山东省随机选取1870例研究对象,利用ELISA方法进行HCMVIgM、IgG检测,并进行血型、SDF1和CCR2受体基因的多态性检测。对HCMVIgM和IgG阳性率进行分析,研究其与地区、性别、职业、年龄、血型以及SDF1和CCR2受体基因多态性的关系。结果:山东省HCMVIgM阳性率为40.21%,IgG阳性率为48.07%;各地区IgM和IgG有显著差异(P<0.05);女性IgM和IgG显著高于男性;农民和医生IgG显著高于其他职业人群;随年龄增加,IgG阳性率增加;HCMV感染与血型、SDF1和CCR2受体多态性无显著性关联。结论:山东省HCMV现行感染率较高,与地区、性别、职业、年龄等因素相关,与血型、SDF1和CCR2受体多态性无关。

联合检测CA125、CA19-9作为卵巢上皮癌诊断及疗效观察指标的研究

目的 :探讨CA12 5、CA19 9联合检测在卵巢上皮癌诊断及疗效观察中的意义。方法 :利用ELISA方法对卵巢上皮癌、子宫内膜异位症和乳腺癌与正常对照组同时进行CA12 5、CA19 9的检测。结果 :卵巢癌CA12 5诊断灵敏度高 ,术前水平明显高于术后和其它各组。CA12 5与CA19 9联合检测使卵巢癌检出率明显提高。结论 :CA12 5是卵巢上皮癌诊断及判断预后的特异性指标 ,CA12 5和CA19 9联合应用可明显提高卵巢上皮癌检出率。

AFP,AFU,GPDA对原发性肝癌的联合检测

对４７例原发性肝癌病人，３５例肝良性病病人，５１例正常对照进行了血清甲胎蛋白（ＡＦＰ）、α－Ｌ岩藻糖苷酶（ＡＦＵ）、甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶（ＧＰＤＡ）的检测。结果显示单独检测ＡＦＰ阳性检出率最高，其次为ＡＦＵ，ＧＰＤＡ最低；联合检测可明显提高阳性检出率，但特异性降低。对三者分别进行相关性分析，结果说明三者无相关性；肝癌病人３种指标在有无肝外转移间无统计学差异。

端粒及端粒酶研究的新进展

端粒是染色体末端高度保守的重复核苷酸序列，对染色体具有保护作用，随着细胞分裂的不断进行，端粒逐渐缩短，减少到一定程度，细胞就趋向衰亡，被认为是细胞有丝分裂的“生物钟”。端粒酶是影响端粒长度的主要因素，以其ＲＮＡ为模板，向端粒末端添加（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ序列，使端粒延长，从而延长细胞的寿命甚至使其永生。端粒酶的功能区主要在ｈＴＲ的４４－２０３核苷酸区，３ｐ和１０ｐ上存在着编码调整端粒酶的基因，Ｅｓｔｌ可能是端粒末端结合蛋白，是端粒酶的识别位点。正常情况下，此酶活性较低或无活性，但在干细胞、永生型细胞或肿瘤细胞此酶活性较强。端粒酶的活性主要与细胞分裂速度、细胞周期因素及细胞分化程度有关，细胞分化程度低、细胞增生活跃及肿瘤细胞在Ｓ期时活性较高。在恶性肿瘤中端粒酶活性较高，但在良性肿瘤和非肿瘤中活性较低，因而可利用ＴＲＡＰ技术对端粒酶活性进行检测来进行肿瘤诊断及良恶性鉴别。同时可利用端粒酶抑制剂能抑制端粒酶的活性，缩短端粒，使恶化细胞良转，达到治疗肿瘤的作用，而且还可利用检测端粒酶作为治疗效果好坏的指标。

神经节苷脂肿瘤疫苗研究进展

神经节苷脂是一类细胞膜上的糖鞘脂类化合物 ,其伸展于胞膜表面的糖基具有免疫原性抗原决定簇 ,能够诱发IgM抗体反应。由于其在多种神经外胚层起源的肿瘤组织中过度表达 ,因此可作为肿瘤疫苗的靶分子。各种经过加工、处理的神经节苷脂肿瘤疫苗的免疫原性明显增强 ,诱导产生IgM及IgG。经多种动物模型及临床实验证明 ,其抗体产生的水平和持续时间与肿瘤患者的预后明显相关 ,因此在肿瘤生物治疗上是一很有前景的研究目标。

氟化物对限制性内切酶酶切活性改变的研究

目的 :探讨氟化物对限制性内切酶酶切作用改变的影响。方法 :常规方法提取纯化PBR32 2质粒 ;将NaF与PBR32 2质粒 37℃共同作用 1h ,再用限制性内切酶BamH1 对PBR32 2质粒进行酶切 3h ,同时将NaF作用的PBR32 2用层析柱纯化后再进行酶切反应 ;将酶切产物进行电泳 ,观察结果并拍照。结果 :随着NaF浓度的增加 ,BamH1 对PBR32 2的酶切作用减弱 ,当加入 5mmol LNaF时 ,BamH1 几乎无酶切活性 ,而对加入 5mmol LNaF的PBR32 2用层析柱进行纯化 ,以除去NaF ,再对其进行酶切 ,可完全切开。而且氟离子可导致酶切片段在电泳中显示拖尾现象。结论

CD-TK和HSV-TK两种自杀基因体系对前列腺癌细胞的杀伤作用

背景与目的:自杀基因治疗是一种有前景的基因治疗方法,本实验通过观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase,HSV-TK)和CD-TK两种自杀基因体系对前列腺癌细胞PC-3m的杀伤效果,探讨该基因治疗在前列腺癌治疗中的应用价值。方法:应用逆转录病毒载体将HSV-TK基因和CD-TK融合基因分别转染PC-3m细胞,经RT-PCR鉴定后,MTT法检测丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)、5-氟胞嘧啶(5-flucytosine,5-FC)前体药物单一或联合应用对转染后PC-3m细胞的杀伤作用,以未转染的PC-3m细胞作对照。结果:GCV对转染后PC-3m细胞有较强的细胞毒作用,半数抑制浓度为8.34μg/ml,但旁观者效应不明显;5-Fc则有显著旁观者效应,当混育细胞中转染细胞比例是5%时即可出现;联合用药具有协同作用,两药相互作用指数小于1.0。结论:CD-TK自杀基因体系对前列腺癌细胞具有显著杀伤作用,明显优于单用HSV-TK基因体系,深入研究意义较大。

Fischer 344大鼠上皮性卵巢癌动物模型的建立及其生物学特性

目的 :在具有正常免疫功能的Fischer3 44大鼠体内建立卵巢上皮癌模型并探讨其生物学特性。方法 :体外培养近交系Fischer3 44大鼠卵巢上皮低分化腺癌细胞株NuTu 1 9,采用细胞计数和MTT法观察细胞生长情况及其对顺铂 (cDDP) ,5 氟尿嘧啶 (5 FU)和足叶乙甙 (VP 1 6)的敏感性。将对数生长期的NuTu 1 9按 1× 1 0 7、1× 1 0 6和 1× 1 0 5细胞 /只接种于雌性Fischer3 44大鼠腹腔内 ,建立卵巢癌腹腔转移模型 ,观察成瘤率、肿瘤生长、播散情况及动物生存期 ,并对腹腔肿瘤进行病理学检查和原代组织培养 ,确定肿瘤的存在及性质。结果 :在体外培养条件下NuTu 1 9细胞生长迅速 ,其倍增时间约 1 8.9h。NuTu 1 9对cDDP和VP 1 6等卵巢癌常用化疗药物高度敏感。将不同数量的NuTu 1 9细胞接种大鼠腹腔后 ,成瘤率为 1 0 0 % ,迅速发生腹腔播散并产生大量血性腹水 ,其生物学行为与人类卵巢上皮癌相似。肿瘤细胞负荷增加 ,动物生存期明显缩短 (P <0 .0 1 )。模型动物肿瘤组织病理学检查证实胸腹腔多脏器肿瘤播散 ,腹腔肿瘤原代培养证实肿瘤组织的细胞形态和生物学特性与NuTu 1 9细胞一致。结论 :在具有正常免疫功能的大鼠体内建立卵巢上皮癌动物模型 ,有助于了解卵巢癌生物学及免疫学特性 。

奥曲肽对紫杉醇抑制非小细胞肺癌细胞的增效作用

目的:探讨生长抑素类似物奥曲肽(octreotide)对紫杉醇抑制非小细胞肺癌细胞的增效作用及其可能的机制。方法:RT-PCR检测非小细胞肺癌细胞株A549和H157生长抑素受体(somatostatin receptor,SSTR)1～5 mRNA的表达;检测不同时间和浓度梯度的奥曲肽对两株细胞的抑制率,光镜下观测奥曲肽作用后细胞形态学的变化;MTT法检测奥曲肽与紫杉醇对两细胞株增殖的抑制是否具有协同作用;采用流式细胞仪检测奥曲肽、紫杉醇以及两者联合作用时A549细胞的凋亡率;荧光实时定量PCR检测奥曲肽作用后细胞多药耐药相关基因的改变。结果:A549细胞检测到SSTR1～SSTR5 mRNA的表达,而H157细胞只有SSTR1和SSTR4 mRNA的表达。奥曲肽对A549细胞增殖具有抑制作用并具有时间(24、48、72 h)和浓度(1～1000 nmol/L)依赖性,在光镜下可观测到细胞细胞受损伤的形态学改变;而对H157细胞无抑制作用。对于A549细胞,125、250、500 nmol/L奥曲肽作用48 h可明显增加其对紫杉醇化疗的敏感性(P<0.01),并能诱导细胞凋亡,但未增加与紫杉醇联合作用后细胞的凋亡率;而对H157细胞,奥曲肽未发现化疗增敏作用。奥曲肽可下调A549细胞多药耐药相关基因MDR-1、MRP-1的表达(P<0.05,P<0.01),而对H157细胞多药耐药相关基因的表达无影响。结论:奥曲肽可提高SSTR受体阳性的非小细胞肺癌细胞对紫杉醇的敏感性,下调多药耐药相关基因的表达是其可能的机制之一。

3种卵巢癌细胞中hTERT转录水平及其与端粒酶活性的相关性研究

背景与目的:端粒酶在约90%的肿瘤细胞中有活性而在绝大多数正常细胞中受抑,催化亚单位端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)是端粒酶的重要组成部分,其表达的调控主要发生在转录水平。端粒酶、hTERT、hTERT启动子三者之间密切相关。本研究探讨卵巢癌细胞系中hTERT启动子的活性及其与hTERTmRNA表达和端粒酶活性之间的关系。方法:应用脂质体转染法将hTERT核心启动子基因转入3种卵巢癌细胞OVCAR3、SKOV3、3AO及正常卵巢上皮细胞中,并用荧光素酶检测实验检测其中hTERT启动子的活性;应用RT-PCR半定量法检测这4种细胞中hTERTmRNA的表达水平;应用PCR-ELISA定量检测这4种细胞中端粒酶的活性。同时以端粒酶阳性的永生化人胚肾成纤维细胞HEK293作为阳性对照,以端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞HELF作为阴性对照。结果:OVCAR3、SKOV3、3AO细胞及正常卵巢上皮细胞中的hTERT启动子活性(视每种细胞中pGL3-control的启动子活性为100%)分别为31.4%、20.3%、17.7%和0.3%;hTERTmRNA的相对表达水平(视SKOV3的表达水平为1.00)分别为1.30、1.00、0.63和0;端粒酶活性分别为0.580、0.414、0.386和0.103(>0.200时定为阳性)。3种卵巢癌细胞中hTERT启动子活性、hTERTmRNA表达水平和端粒酶活性均特异性增高。

γ-干扰素对姜黄素抑制人卵巢癌细胞株3AO增殖的影响

目的 :研究γ 干扰素 (IFN γ)对姜黄素抑制人卵巢癌细胞株 3AO增殖的影响。方法 :采用MTT法计算细胞存活率、Giemsa染色观察细胞形态变化及凋亡情况、流式细胞术检测细胞周期变化。结果 :姜黄素可明显抑制 3AO细胞的生长 ,其半数生长抑制率 (IC50 )约为 1 8.5 μmol/L;姜黄素将肿瘤细胞聚集在S期和G2 /M期并可诱导细胞凋亡。IFN γ与姜黄素联用后 ,使上述作用明显增强 ,与两药单用组相比有统计学差异(P <0 .0 5 )。结论 :IFN γ可协同姜黄素抑制人卵巢癌细胞株