沙门氏菌能力验证样品的研制及其应用

目的研制沙门氏菌分离培养及血清分型能力验证样品,并应用于沙门氏菌的能力验证。方法能力验证样品包括5瓶,其中3瓶阳性,2瓶阴性。阴性样品仅含有背景细菌,阳性样本在背景菌的基础上添加有沙门氏菌,3件阳性样品分别含有不同的血清型沙门氏菌。为防止数据串通,将参试实验室随机分成5组,每组实验室获得的质控样组合不同。为进行沙门氏菌能力验证样品评价,随机抽取冻干质控样品20瓶,参照本次能力验证推荐的GB 4789.4-2010对样品进行均匀性检验,阳性样品至少检出1种血清型沙门氏菌,阴性对照样品应不得检出沙门氏菌。将沙门氏菌能力验证样品分别在-30、4、25和37℃下储藏28 d监测其储藏稳定性。结果沙门氏菌的质控样在均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均能满足质控样使用的要求。在166家实验室反馈结果中,123家结果评定为满意,占74.1%;28家结果为不满意,占16.9%;15家结果评定为可疑,占9.0%。结论沙门氏菌的能力验证样品可以满足此次能力验证的需求,本次能力验证可以真实的反应参试单位的检测水平。

阪崎克罗诺杆菌标准物质研制

目的采用冷冻干燥技术制备均匀性和稳定性符合要求的阪崎克罗诺杆菌标准物质,用于实验室内部质量控制。方法对使用菌株阪崎克罗诺杆菌(45403)的生化特征、16SrRNA序列、质谱特征进行确认。采用冷冻干燥技术制备含量为103 CFU/样品的菌球。参照CNAS-GL29《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》,对20件样品进行均匀性检验,采用单因素方差分析对结果进行统计分析。将样品分别于-20、2、37℃条件下保藏,对其储藏稳定性和运输稳定性进行评价。组织5家实验室进行协同标定。使用20件婴儿配方乳粉作为基质对阪崎克罗诺杆菌标准物质的使用效果进行确认。结果阪崎克罗诺杆菌(45403)生化鉴定结果、16SrRNA序列的NCBIGenebank比对结果、质谱鉴定结果均为阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)。采用单因素方差分析进行均匀性检验, F=1.067, P=0.442,符合标准物质的要求。于-20℃保藏170 d,于25、37℃保藏14d后,样品仍然稳定。经5家实验室协同标定,样品含量均为103 CFU/样品。20件婴儿配方乳粉作为基质加入阪崎克罗诺杆菌标准物质进行检验,均可以检出。结论阪崎克罗诺杆菌(CMCC45403)的生化特征、16SrRNA序列分析、蛋白飞行质谱特征均符合克罗诺杆菌属的典型特征。均匀性、储藏稳定性、运输稳定性及适用性的验证实验结果均符合标准物质的要求。

沙门氏菌质控样的研制及其在能力验证中的应用

目的研制均一性和稳定性符合能力验证要求的质控样品,并将质控样品用于沙门氏菌的能力验证。方法 (1)通过对沙门氏菌质控样品的储藏稳定性、运输稳定性及均一性的检验,对沙门氏菌质控样品进行评价。(2)实验室能力验证中考核方案的设计:一套考核样品包括18份沙门氏菌的质控样品,设置3个浓度水平,阴性空白对照、阳性对照、101CFU水平和100CFU水平。(3)防止数据串通措施:将参试实验室随机分成2组,每组实验室获得的质控样品不同;低浓度样品的结果是双盲。结果沙门氏菌的质控样品在均一性、储藏稳定性和运输稳定性均能满足质控样品使用的要求;在考核中,76家实验室有7家实验室不合格,35家实验室优秀,34家实验室合格。结论沙门氏菌的质控考核样品可以满足能力验证的需求,本次能力验证可以真实地反映参试单位的检测水平。

婴儿肉毒中毒

综述了国内外婴儿肉毒中毒的有关研究,从肉毒梭菌的生物学特性、婴儿肉毒中毒的流行病学、婴儿肉毒中毒的风险因素、临床症状及诊断方法进展方面进行了介绍。分析表明,婴儿肉毒中毒是一种会危及婴儿生命的疾病,需加强临床诊断和实验室的鉴定手段,并加强对婴儿肉毒中毒预防。

应用二重PCR对沙门菌属和肠炎沙门菌检测

〔目的〕建立快速检测肠炎沙门菌的检测方法。〔方法〕以属特异性引物ST11、ST15和肠炎沙门菌的特异性引物Sef1167、Sef478构建二重PCR反应体系 ,对样本进行沙门菌属的鉴定同时对肠炎沙门菌进行检测。〔结果〕实验证明本方法可以准确的对沙门菌属进行鉴定 ,同时也能比较准确的对肠炎沙门菌进行鉴定。〔结论〕为沙门菌食物中毒的鉴定提供更加快捷的检测方法。

诺如病毒检验用大肠杆菌噬菌体MS2标准物质的研制

目的制备均匀性和稳定性符合要求的大肠杆菌噬菌体MS2标准物质,用于诺如病毒检验过程质量控制。方法对大肠杆菌噬菌体MS2(CMCCPh001)进行分子生物学确认。采用冷冻干燥技术制成微球状标准物质,并进行均匀性、长期稳定性、短期稳定性检验。以牡蛎等5种样品作为基质,对使用效果进行确认。结果制备的样品呈球形、白色、大小均一,其均匀性符合要求,经-20℃12个月长期储存,样品稳定,经4℃28 d以及37℃5 d的短期储存,样品稳定。阈值循环数(threshold cycle,Cq)值与均匀性检平均值差异不大。牡蛎等5种样品使用效果确认实验表明,该标准物质可以作为食品诺如病毒检验过程质量控制使用。结论大肠杆菌噬菌体MS2(CMCCPh001)分子水平鉴定结果符合大肠杆菌噬菌体MS2特征。均匀性、长期稳定性、短期稳定性及适用性实验结果符合作为诺如病毒检验过程质量控制标准物质的要求。

中度嗜热氧化硫细菌及中度嗜热氧化亚铁细菌在难处理铜精矿浸出中的应用

从山西某大型煤矿的煤矸石堆中取样,用选择性培养基筛选到了一株中度嗜热氧化硫细菌和一株中度嗜热氧化亚铁细菌,并对其生理特性进行了初步研究。中度嗜热氧化亚铁细菌最适温度为55℃左右,为专性化能自养菌,通过将二价铁氧化成三价铁获得生长能量。嗜热的氧化硫细菌最适温度为55℃左右,为兼性化能自养细菌,可以通过氧化硫、二价铁获得生长能量,同时还能在LB培养基上以异养方式生长。对比这两种细菌对铜精矿的浸出能力,中度嗜热氧化硫细菌较中度嗜热氧化亚铁细菌更易使浸出体系维持较低的pH,浸出能力更强。

弯曲菌菌种冷冻保存及复苏方法的研究

目的探索一种简单、方便、有效的弯曲菌菌种保存方法。方法采用含30%甘油的脑心浸液肉汤,将实验室保存的19株弯曲菌于-30℃和-70℃分别保存,每个菌株3个菌种管。1年后,采用5%脱纤维羊血的布氏肉汤进行增菌,然后转种哥伦比亚血平板,比较存活效果。结果-30℃条件下采用多管法保存弯曲菌可以获得与-70℃条件下保存相当的效果。结论采用多管法(每株菌3个菌种管)于-30℃冷冻保存弯曲菌是一个简单、方便、有效、实用的方法。

应用PCR方法对生鸡肉中分离到的空肠弯曲菌进行鉴定

目的:对北京市市场销售的肉制品的空肠弯曲菌污染的状况进行调查,并建立快速的弯曲菌PCR鉴定的方法。方法:采用中国疾病预防控制中心下发的监测方法对北京市超市和集贸市场销售的鸡肉采集100件并进行检测,生化鉴定采用API Campy系统进行鉴定,同时采用针对空肠弯曲菌h ipO设计的引物对分离的弯曲菌进行鉴定。结果:共有4件检出空肠弯曲菌,采用PCR方法进行鉴定的结果与生化方法鉴定的结果一致。结论:在北京销售的鸡肉中存在空肠弯曲菌的污染,带菌率为4%,针对h ipO设计的引物可以对空肠弯曲菌进行快速鉴定。

嗜热氧化亚铁菌株的筛选及其特性研究

为了获得细菌冶金的嗜高温细菌 ,取山西煤矿煤矸石堆的样品 .用选择培养基 ,5 0℃ ,pH2 5～ 3 0 ,恒温水浴摇床振荡培养 ,选择出了快速氧化Fe2 +为Fe3 +,对元素硫有较弱氧化能力 ,最适生长温度 5 5℃ ,最适pH2 3左右 ,专性自养生长的嗜热氧化亚铁菌株 .此菌在细菌冶金中具有一定潜力 .

16S rRNA基因序列、生化鉴定、质谱3类方法鉴定常见微生物的结果分析

目的比较16SrRNA基因序列、生化鉴定、质谱鉴定3类实验方法分析沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的鉴定结果的异同。方法挑选沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌各50株,分别进行16S rRNA基因序列测定、VITEK COMPACT 2生化鉴定、质谱鉴定3类实验,并比较3类实验的鉴定结果。结果 3类实验方法对大部分沙门氏菌鉴定在属水平,生化鉴定方法对少数血清型鉴定到种水平;对金黄色葡萄球菌均鉴定到种水平; 16SrRNA基因序列、生化方法对蜡样芽孢杆菌鉴定到属水平,质谱鉴定到种水平。结论 3类实验方法对大部分沙门氏菌、所有金黄色葡萄球菌鉴定水平相同,质谱鉴定蜡样芽孢杆菌的结果更准确,且质谱鉴定时效性更高。

北京市食品中五种食源性致病菌污染状况调查研究

〔目的〕了解北京市食品中沙门菌、单增李斯特菌、EHECO157:H7、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的分布状况、动物储存宿主的种类、菌株生物学特点 ,初步确定可能污染上述致病菌的高危食品 ,为食物中毒监测提供科学依据。〔方法〕依据国标方法 ,采用进口显色培养基 ,对样本分别进行沙门菌、单增李斯特菌、EHECO157:H7、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌分离、生化及血清学鉴定。〔结果〕检测生肉 (牛、猪、鸡 )、熟肉、生牛奶、冰激凌、酸奶各生食水产品六类样品共 92 7件 ,共检出致病菌 197株 ,总检出率 2 1.3 % ;其中分离沙门菌 3 3株 ,检出率 3 .2 % ;单增李斯特菌 99株 ,检出率 9.6% ;金黄色葡萄球菌 65株 ,检出率 6.3 %。EHECO157:H7和副溶血性弧菌均未检出。 6类食品中致病菌阳性率最高的为生肉 ( 3 7.7% ) ,其次为生奶 ( 2 4.7% ) ,酸奶中未检出致病菌。〔结论〕北京市居民主要消费食品存在食源性致病菌污染 ,其中生肉和生奶是主要污染食品品种 ,单增李斯特菌在肉与肉制品中污染率较高 ( 17.1% ) ,生肉 (鸡肉 )中沙门菌带菌率较高 ( 19.4% ) ,主要血清型为肠炎沙门菌 ,生牛奶中金黄色葡萄球菌带菌率高 ( 2 4.7% ) ,生食水产品未检出副溶血性弧菌 ,但存在金黄色葡萄球菌的间接污染 。

试剂盒法快速检测婴幼儿乳粉中叶酸含量

目的建立试剂盒法快速检测婴幼儿乳粉中叶酸的含量。方法以Tris缓冲液稀释样品,加入冻干的干酪乳杆菌测试菌球,采用Costar 3599细胞培养板培养,使用酶标仪测定结果。幵同时检测了28批次婴幼儿乳粉叶酸的含量。结果本试剂盒方法回收率为95%～105%,定量检测限为0.050ng/mL,日间精密度为0.6%,日内精密度为0.7%。采用试剂盒方法与GB 5413.16-2010试管法同时检测28批次婴幼儿乳粉中叶酸的含量,检测结果无显著性差异(P=0.598),乳粉中叶酸含量的合格率为100%。结论该方法操作简单,灵敏度高,重现性好,可用于测定婴幼儿乳粉中叶酸的含量。

食品中副溶血性弧菌检验能力验证样品的研制及其应用

目的研制食品中副溶血性弧菌检验能力验证样品,并应用于副溶血性弧菌能力验证试验中。方法能力验证样品包括0～3瓶阳性样品和0～3瓶阴性样品。阴性样品仅含有背景细菌,阳性样本在背景菌的基础上添加有副溶血性弧菌。为防止数据串通,编制1～180的随机数字表,其中90个随机数字作为阳性样品编码,另外90个随机数字则用为阴性样品编码。随机抽取冻干质控阳性样品、阴性样品各20瓶,参照本次能力验证推荐的GB4789.7-2013对样品进行均匀性检验,阳性样品均需要检出副溶血性弧菌,而阴性对照样品应不得检出副溶血性弧菌。将副溶血性弧菌能力验证样品分别在?30、4℃储藏30d监测其储藏稳定性,同时在25和37℃下储藏7 d监测其运输稳定性。结果副溶血性弧菌的质控样在均匀性、储藏稳定性和运输稳定性均能满足质控样使用的要求。在39家实验室反馈结果中,36家结果评定为满意,满意率为92.3%。结论食品中副溶血性弧菌能力验证样品可以满足此次能力验证的需求,国内实验室大部分能满足考核要求,仍有部分实验室需要提高检验检测能力。

甲烷八叠球菌的富集培养和固定化介质的选择

用亨盖特 (Hungate)厌氧技术 ,以甲醇为唯一碳源 ,获得了甲烷八叠球菌的富集培养物。采用直接计数法和MPN(mostprobablenumber)法对甲烷八叠球菌的数量进行测定。选择不同包埋剂对甲烷八叠球菌进行固定化 ,并对其成球效果及产甲烷特性进行了研究。结果表明 ,以AM 4为包埋剂对甲烷八叠球菌进行固定化可得到较好的效果。

核糖体分型和脉冲场凝胶电泳在霍乱疫情中的应用

[目的]分析同起霍乱疫情、不同来源的霍乱分离菌遗传相关性,追溯菌株来源,为有效控制疫情提供依据。[方法]霍乱疫情分离的39株霍乱菌在常规病原学的基础上,PCR测CT与ZOT毒素后,用核糖体分型(RT)技术进行分子分型,用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析DNA片段并对其结果聚类。[结果]两起霍乱暴发疫情中,同起疫情菌株的血清学和噬菌体-生物分型结果不完全一致,CT与ZOT均阴性;同起疫情菌株的PFGE和RT的图谱结果基本相同,而与散发疫情菌株的PFGE和RT的图谱结果不同。[结论]PFGE和RT有助于判断不同来源霍乱菌株的亲缘关系,及时溯源,从而有效地控制疫情的蔓延。

食品检测即用型液体培养基产品的评价研究

目的对即用型缓冲蛋白胨水、3%氯化钠碱性蛋白胨水、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤培养基进行质量评价。方法使用即用型培养基和新鲜配制的培养基对已完成生化确认的10株沙门氏菌、5株阪崎肠杆菌、15株副溶血性弧菌、15株肠杆菌科细菌共45株目标菌及5株干扰菌进行检测,确定菌株的灵敏度和特异性;平行培养0、6和24 h后对比即用型培养基增菌效果与新鲜配制的培养基是否存在差异。结果使用即用型培养基与新鲜配制的培养基对全部目标菌与干扰菌的6 h、24 h细菌生长的检验结果未见显著差异(全部单因素方法分析结果均为P>0.05)。结论被测试目标菌及干扰菌在即用型培养基中的生长结果可满足GB 4789.28-2013对非选择性及选择性增菌培养基的质量要求。

食品检验用解脂耶氏酵母菌标准物质制备研究

目的制备解脂耶氏酵母菌检验用标准物质,以满足实验室酵母菌日常检验质量控制及实验室间比对需求。方法通过生化、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)及转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)位点测序,对研究用菌株进行菌种鉴定确认后冻干,制备10^(4)CFU/样品浓度的标准物质。参照CNAS—GL003:2008《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》等的要求进行均匀性检验后,采用单因素方差分析对结果进行评价。样品放于-20、4、25和37℃条件下,分别进行运输稳定性检验及储存稳定性检验。依据GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》,验证标准物质在真实食品样品中适用性。结果CMCC98025经生化鉴定为解脂耶氏酵母菌,准确度为93%;MALDI-TOF MS鉴定结果为解脂耶氏酵母,分数为2.012;ITS位点测序与美国国家生物信息中心基因库中序列比对,匹配最优结果为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。均匀性测试结果符合正态分布,F0.05(19,20)=2.137,F=1.697<F0.05,符合均匀性要求。25及37℃中放置7 d稳定,标准物质中菌含量仍保持在10^(4)CFU/样品;4℃储存28 d及-20℃储存90 d,菌含量为10^(4)CFU/样品,复苏率均在91%以上。本标准物质加入7类食品样品基质均可检出,回收率为81.3%。经3家实验室协作标定,本标准物质平均浓度为2.0×10^(4)~3.0×10^(4)CFU/样品。结论本研究制备的解脂耶氏酵母菌标准物质均匀性、稳定性、真实食品样品中应用验证及协作标定结果均符合要求,可应用于食品中解脂耶氏酵母菌检验。

基于DNA测序方法检测生鲜肉中5种动物源性成分

目的建立生鲜肉中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分的DNA测序鉴别方法,并对采集自北京各地区生鲜肉品进行检测验证。方法合成动物线粒体上12S rRNA、cytochrome b、cytochrome c oxidase基因引物,建立猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分的DNA测序鉴别方法,并对50份猪、牛、羊、鸡、鸭肉品进行检测。结果使用线粒体上12S rRNA、cytochrome b、cytochrome c oxidase基因引物对猪、牛、羊、鸡、鸭肉品进行扩增,分别获得456、400和710 bp大小的DNA片段。只有12S rRNA基因引物均可对此5种动物源性成分扩增且效果良好。扩增产物进行序列测定。根据序列构建的系统进化树发现,此方法可有效区分样品中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分。结论此方法快速、简便,可准确检测50种生鲜肉样品中的动物源性成分,作为肉类鉴别的新方法。

铜绿假单胞菌能力验证样品的研制及应用研究

目的:研制符合能力验证要求的铜绿假单胞菌质控样品,并将该质控样品用于铜绿假单胞菌的能力验证。方法:通过对冻干工艺和冻干保护剂的研究,研制出均一性、储藏稳定性和运输稳定性均符合要求的能力验证样品。本次能力验证样品为2瓶以粉底膏为基质的铜绿假单胞菌样品,通过产生随机数字的方式对样品进行编码,然后随机分配给参试实验室。结果:铜绿假单胞菌的质控样品的均一性、储藏和运输稳定性均符合能力验证中质控样品的要求;全国65家实验室中62家结果评定为满意,满意率为95.38%。3家不满意的实验室中2家为省级检验机构,1家为地市级检验机构。省级检验机构的满意率为94.28%,地市级检验机构的满意率为95.65%。结论:研制的铜绿假单胞菌质控考核样品可以满足能力验证的需求,本次能力验证真实地反映了参试单位的检测水平。