西门塔尔牛表皮干细胞的分离培养与生物学特性研究

旨在建立西门塔尔牛表皮干细胞(epidermal stem cell, EpSCs)分离培养体系,探究其生物学特性,为西门塔尔牛种质资源保存提供新方法,为干细胞治疗研究提供种子细胞。采用3~4月龄西门塔尔牛背部表皮,通过酶消化法和组织贴壁法两种方法分离培养西门塔尔牛EpSCs,绘制EpSCs生长曲线探讨其增殖能力。通过免疫荧光鉴定EpSCs表面标记物(ITG β1、P63和CD71),通过RT-PCR分析EpSCs特异性基因(ITG β1、KRT19和ITG α6)表达情况。通过体外诱导EpSCs分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞检测其分化潜能。结果显示,组织块贴壁法获得的EpSCs纯度较低,酶消法获得的EpSCs纯度较高,细胞传代至P28代时开始逐渐老化。EpSCs细胞生长曲线呈“S”型。免疫荧光结果显示EpSCs表面特异性标记物ITG β1、P63和CD71呈阳性表达,RT-PCR结果显示EpSCs高度表达ITG β1、KRT19和ITG α6,不表达CD31基因。EpSCs诱导分化脂肪细胞时,产生可被油红O着色的脂滴,经鉴定细胞阳性表达脂肪细胞PPAR-γ和LPL特异性基因。EpSCs诱导分化成骨细胞时,形成可被茜素红染色呈橙红色的钙结节,且细胞阳性表达CollagenⅠ和RUNX2基因。EpSCs诱导分化软骨细胞时,透明状软骨基质经阿利新蓝染色呈蓝色,且细胞阳性表达软骨细胞特异性基因BGN和CollagenⅡ。上述结果表明,成功从西门塔尔牛胎牛表皮中分离得到生长状态良好的西门塔尔牛EpSCs,且具有向脂肪、成骨和软骨细胞等中胚层细胞分化的潜能,建立了西门塔尔牛EpSCs体外分离培养体系。

北京油鸡角膜缘干细胞分离培养及分化潜能研究

【目的】研究北京油鸡角膜缘干细胞(LSCs)分离、培养、鉴定及多向分化潜能等生物学特性。【方法】取10胚龄健康北京油鸡鸡胚的角膜缘,采用分散酶Ⅱ(dispaseⅡ)联合胰蛋白酶二步法分离细胞,进行体外培养,绘制生长曲线,通过免疫荧光和RT-PCR技术鉴定LSCs特异性标志物细胞角蛋白3(CK3)、CK12、细胞周期调控蛋白p63、ATP结合盒转运蛋白(ABCG2)和细胞角蛋白19(CK19)的表达;通过成骨和成软骨诱导检测其多向分化潜能。【结果】获得的北京油鸡细胞折光性强、贴壁后呈多角形,生长曲线呈典型的S型,群体倍增时间(PDT)随着代次的升高逐渐下降;免疫荧光检测结果表明,分离的细胞中ABCG2、p63和CK19均呈阳性表达,CK3和CK12不表达;RT-PCR检测结果表明,分离的细胞表达p63、CK19、ABCG2,不表达CD45,说明分离的细胞为LSCs。LCSs成骨诱导分化后,可见被茜素红染色的矿化钙结节,RT-PCR检测结果表明其表达成骨关键基因骨桥蛋白(OPN)和Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ);成软骨诱导分化后,可见被阿利新蓝染色的软骨组织,RT-PCR检测结果表明其表达成软骨细胞关键基因转录因子性别决定区Y框9(SOX-9)和Ⅱ型胶原蛋白(Col-Ⅱ)。【结论】本研究成功从10胚龄北京油鸡胚胎角膜缘中分离LSCs,且其具有良好的增殖活力及成骨和成软骨能力,结果可为禽类LSCs的资源保存研究提供参考。

近交系小型猪线粒体基因组分析和家猪系统进化关系分析

广西巴马小型猪是长期近交培育而成的实验小型猪,遗传稳定。本研究拟通过线粒体基因组(mitochondrial DNA,mtDNA)分析来了解近交系的遗传背景,并从mtDNA角度进一步认识中国本土猪种的系统进化关系。实验设计29对特异性引物,PCR扩增和产物测序,拼接出广西巴马小型猪近交系7个世代猪的mtDNA序列;用42个品种猪的mtDNA D-loop区和基因编码区序列分布构建系统进化树。结果表明,广西巴马小型猪的mtDNA大小为16761 bp,碱基组成、基因结构与其他猪种相似;近交系7个世代个体mtDNA发现有46个碱基差异位点,变异率为0.28%,mtDNA序列同源性在99.9%以上,表明该近交系母源单一;基于mtDNA序列构建的系统进化树不能清晰地区分地方品种猪之间的遗传关系。研究结果进一步表明广西巴马小型猪近交系的遗传背景单一,中国本土品种猪的母系关系复杂。