1株牛病毒性腹泻病毒河北株的分离鉴定与遗传演化分析

从河北省保定市某养殖场采集疑似患病毒性腹泻/黏膜病(BVD)的犊牛粪便6份,进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的分离培养,根据GenBank上登录的BVDV 5′-UTR片段设计引物,利用RT-PCR技术对目的片段进行扩增,扩增得到的目的基因片段送至公司测序,测序结果进行同源性分析和系统进化树构建。结果:分离出1株致细胞病变毒株,采用RT-PCR方法扩增出大小为288 bp的特异性条带,与预期大小相符,与GenBank中登录的部分BVDV毒株同源性为92.3%~99.0%,该毒株与T1-5(MN417828)、VR451(AY763031)、BJ175170(MT119454)、MF-1(KY865369)和MF-2(KY865370)在同一进化分支上,亲缘关系最近,将其命名为HB-BDZ。本研究为河北省内BVDV疫苗的制备及牛病毒性腹泻病的防控提供理论依据。

牛源绿脓杆菌的分离鉴定与药敏试验

为了解河北地区绿脓杆菌的感染状况及耐药情况,试验采用传统的细菌分离鉴定、生化鉴定、分子生物学鉴定及药敏试验等方法对该地区6个牛场的83份奶样进行研究。结果表明:从83份牛奶样品中分离出28株绿脓杆菌,其分离率可达到33.73%,分离菌株在普通营养琼脂和十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基上的生长状态良好;革兰氏染色镜检分离菌为排列不规则的阴性短杆菌;分离菌的葡萄糖、尿素、枸橼酸盐和硝酸盐还原试验为阳性,麦芽糖、蔗糖、甘露醇、硫化氢试验、V-P试验和吲哚试验均为阴性,根据生化鉴定管说明书鉴定分离菌为绿脓杆菌;绿脓杆菌eta基因PCR扩增和序列测定再次确定该分离菌为绿脓杆菌;所有分离菌均表现出不同程度的耐药,其中对氨苄西林、复方新诺明、链霉素和氟苯尼考等药物的耐药情况严重,而对新霉素、环丙沙星、丁胺卡那及呋喃唑酮等药物敏感。说明绿脓杆菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌,新霉素、环丙沙星、丁胺卡那及呋喃唑酮等药物可作为治疗绿脓杆菌的首选药物。

河北省部分地区致犊牛腹泻主要病原分布特征

为了明确河北省内致犊牛感染性腹泻主要病原,本研究自河北省8个地区采集775份犊牛腹泻粪便样品,根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR基因、牛冠状病毒(BCoV)N基因、牛轮状病毒(BRV)VP6基因和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因序列设计特异性引物,参照文献合成隐孢子虫18S rRNA和大肠杆菌16S rRNA引物,利用PCR方法对BVDV、BCoV、BRV、IBRV、隐孢子虫和大肠杆菌进行检测。结果显示,775份犊牛腹泻临床样品中,BVDV的阳性率为27.11%(205/775);BCoV的阳性率为17.52%(137/775);BRV的阳性率为9.85%(77/775);IBRV的阳性率为3.71%(29/775);隐孢子虫的阳性率为12.28%(96/775);大肠杆菌的阳性率为20.46%(160/775);还有9.10%的样品未检测出病原。在河北省部分地区采集的犊牛腹泻粪便样品中,BVDV检测阳性率最高为27.11%,在冬季犊牛BVDV的感染率最高为40.21%,且唐山和张家口地区奶牛场BVDV的感染率高于其他6个地区。本研究明确了河北省内致犊牛腹泻主要病原,为河北省内犊牛腹泻的防制提供了方向。

河北省奶牛场牛呼吸道疾病综合征病原分离鉴定

为了分离与鉴定河北省奶牛场牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease complex,BRDC)病原,自河北省张家口、秦皇岛、保定、衡水、沧州、石家庄、邯郸等地区规模化奶牛场采集奶牛呼吸道疾病临床病例鼻拭子样品及死亡奶牛的肺脏组织样品,用牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)、牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus stype 3,BPIV3)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhoea virus,BVDV)基因特异性引物进行PCR扩增,初筛阳性的样品进行病毒分离鉴定。用多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida,Pm)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae,Kp)、牛支原体(Mycoplasma bovis,MYPB)和溶血性曼氏杆菌(Mannheimiahaemolytica,Mh)基因特异性引物对所采集样品进行PCR扩增,将初筛阳性样品进行细菌分离鉴定、致病性及药物敏感试验。结果显示,分离出BVDV和IBRV,分别命名为HB-BDZ和HB-XTZ。BVDV分离毒HB-BDZ株E0基因序列与GenBank中发表的其他毒株的同源性为80.5%~99.2%,IBRV分离株HB-XTZ与GenBank其他IBRV参考株gB基因核苷酸同源性为93.8%~100%,同源性分析结果进一步表明,分离毒为BVDV和IBRV。系统发育分析结果显示,分离毒株HB-BDZ与HB-DCZ株(JX046799.1)、JL-1株(KF501393.1)、国外毒株Powder株(JN380089.1)的遗传距离较近,与国内毒株HB-DCZ株同属于Ib亚型。分离株HB-XTZ株与国内XT-IBRV(MF287966)亲缘关系最近,与BHV1.1USA株(KJ652515)和BH80株(AY745877)遗传距离相对较近,而与其他毒株遗传距离较远。利用绵羊血琼脂平板培养基和麦康凯培养基分离出Pm、Kp等2种致病菌,通过生化鉴定和PCR鉴定进一步确定分离菌为Pm、Kp。序列测定及分析结果显示,Pm分离株kmt基因与GenBank其他参考菌株核苷酸序列的同源性为96.4%~100%,与MH06873.1的亲缘关系最近。Kp分离株phoE基因核苷酸序列与GenBank其他参考菌株的同源性为96.5%~99.5%,与AF064793.1的亲缘关系最近。Pm、Kp分离菌均对小鼠具有较强的致病性。所有的分离株均表现出不同程度的耐药,Pm的分离株对环丙沙星、氧氟沙星、氟苯尼考、阿米卡星4种抗生素敏感;Kp的分离株对氧氟沙星、阿米卡星、新霉素3种抗生素中度敏感。

奶牛牛病毒性腹泻病毒与冠状病毒混合感染的PCR诊断

为了对河北省石家庄市某奶牛场发病及死亡奶牛进行确诊,试验对腹泻奶牛的粪样进行了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛冠状病毒(BCoV)PCR检测,同时对病死奶牛脏器样品进行BVDV、BCoV、传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)及牛细小病毒(BPV)的PCR检测。试验结果显示,6份粪样BVDV阳性率为50%,BCoV阳性率为33.3%,同一份粪样中可同时检测出BVDV和BCoV两种病毒。小肠、肺脏和肝脏中均检出BVDV和BCoV,未检测出IBRV、BRV和BPV。结果表明,BVDV和BCoV为阳性,IBRV、BRV和BPV结果为阴性。最后确诊为BVDV和BCoV的单一感染和混合感染。

河北省致犊牛腹泻主要病原多重PCR检测方法的建立

为建立一种能同时检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的多重PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的BVDV的5′-UTR序列、BRV的VP6基因和IBRV的gB基因设计3对特异性引物,通过对反应条件的优化,建立了一种多重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法对牛冠状病毒(BCoV)、牛细小病毒(BPV)、牛隐孢子虫没有交叉反应,特异性较好;灵敏性试验结果显示,该方法对BVDV、BRV和IBRV的最低检出限分别为1.44×10^(5),1.38×10^(5),1.2×10^(5)copies/μL。利用该方法对从河北省部分地区采集的50份犊牛腹泻粪便样品进行检测,结果显示,BVDV和BRV混合感染检出率为18%(9/50),BVDV和IBRV混合感染检测率为14%(7/50),BRV和IBRV混合感染检测率为22%(11/50),3种病毒混合感染率为4%(2/50)。多重PCR检测和单一PCR检测方法均能检出被检样品中的病原,两种方法的总符合率分别为BVDV 90%、BRV 84%和IBRV 88%。该方法比单一PCR检测方法检测阳性率高,优于单一PCR检测方法,表明该方法可应用于临床检测。本研究建立的多重PCR检测方法,能快速、有效、准确地检测出BVDV、BRV和IBRV 3种病毒,对于流行病学调查及疾病的诊断等具有重要意义。

miR-2904在BVDV复制过程中的调控机制

为研究microRNA在致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(cpBVDV)感染过程中对病毒复制和调控炎症反应的作用机制,本研究以MDBK细胞为模型,通过对cpBVDV感染MDBK前后的总RNA进行microRNA芯片反应,筛选与炎症反应相关的显著差异性microRNA,并预测出其靶基因。通过将miR-2904转染至MDBK细胞,探索其在BVDV感染MDBK细胞过程中的调控作用,并验证其靶基因;利用qRT-PCR检测miR-2904、BVDV 5′UTR及相关炎症因子mRNA的表达水平,利用Western blot检测靶基因TNFAIP8L2蛋白表达水平。结果显示,miR-2904是microRNA的候选基因之一,荧光素酶报告结果显示TNFAIP8L2为其潜在的靶基因;炎症反应表明,BVDV感染MDBK细胞后,miR2904的表达水平显著上升(P<0.05),并且相应下调TNFAIP8L2的表达水平;MDBK细胞转染miR-2904mimic后,炎症因子COX-2、IL-8、TNFAIP8L2mRNA以及TNFAIP8L2蛋白的表达水平明显升高(P<0.05);MDBK细胞接种BVDV后转染miR-2904mimic,能显著降低BVDV 5′UTR的表达水平(P<0.05)。结果表明,miR-2904可以抑制TNFAIP8L2的翻译,增强cpBVDV感染MDBK细胞中的炎症反应以及降低BVDV的复制水平。

河北省部分地区犊牛腹泻大肠杆菌优势血清型筛选及兼性菌毛株的致病性

从河北省4个地区的奶牛场采集1月龄左右腹泻犊牛的新鲜粪便,通过病原的分离培养、革兰染色、生化鉴定、16S rRNA基因PCR及测序来分离和鉴定大肠杆菌;采用11种大肠杆菌O因子定型血清对分离菌进行大肠杆菌优势血清型鉴定;利用菌毛特异性引物对优势血清型菌株进行菌毛基因PCR扩增及序列测定和分析,鉴定其所携带菌毛抗原。通过小鼠攻毒试验评价分离得到的大肠杆菌F41菌毛株、K99菌毛株及兼性F41-K99菌毛株的致病性。结果显示,采集的56份犊牛腹泻粪便样品分离鉴定出48株大肠杆菌。大肠杆菌O因子定型血清鉴定结果显示,4个地区流行的犊牛腹泻大肠杆菌优势血清型均为O101型。菌毛PCR测序结果鉴定出6株携带K99菌毛大肠杆菌,7株携带F41菌毛大肠杆菌,其中1株为兼性F41-K99菌毛大肠杆菌。小鼠致病性试验结果显示,3株分离菌对小鼠均有致病性,其中兼性F41-K99菌毛株临床症状最明显,最小致死剂量最低,为1.5×10^(10)CFU/mL,且死亡小鼠的脏器病理变化最严重,所以兼性菌毛株对小鼠的致病性最强。

河北省奶牛乳房炎主要致病菌多重PCR检测方法的建立

为同时检测奶牛源金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和绿脓杆菌,本试验根据GenBank中3种病原菌的nuc、ef-tu和eta基因保守序列分别合成了3对特异性引物,通过对反应条件、反应体系优化,建立了多重PCR检测方法。特异性试验结果表明,该方法与大肠杆菌、克雷伯杆菌、表皮葡萄球菌、巴氏杆菌无交叉反应,敏感性试验结果表明,多重PCR检测方法对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和绿脓杆菌的检出限为10-3 mg/L。应用该方法对150份临床样品进行检测,结果金黄色葡萄球菌与无乳链球菌混合感染检出率为28.7%(43/150),金黄色葡萄球菌与绿脓杆菌混合感染检出率为14%(21/150),无乳链球菌与绿脓杆菌混合感染检出率为11.3%(17/150),3种菌混合感染检出率为6%(9/150)。应用多重PCR检测结果与分离培养诊断方法结果进行比较,均能检测出样品中的病原菌,2种检测方法的总符合率分别为金黄色葡萄球菌92.6%,无乳链球菌91.3%,绿脓杆菌94.6%。该检测方法对奶牛乳房炎的防控、临床监测及疾病诊治具有重要意义。