猪akirin2基因的组织表达谱及序列分析

克隆猪的akirin2基因,并对该基因在猪的18个组织中的分布进行研究。猪akirin2基因编码区全长为612 bp(Gen Bank登录号KC140110.1),推测的氨基酸序列包含203个氨基酸,为酸性蛋白。利用BLAST工具对克隆到的猪akirin2基因序列与人、大鼠、小鼠、绵羊和牛的序列进行同源性比较。采用软件对氨基酸序列进行分析,用相关序列的比对结果进行系统进化树分析。组织分布结果显示,猪akirin2基因在脑组织中高表达,在淋巴、睾丸中表达量相对较低,在心脏、十二指肠、直肠、皮肤、胸腺中几乎检测不到该基因的表达。序列分析结果显示,猪akirin2基因与绵羊和牛的同源性最高,均为96%,与人、小鼠、大鼠的同源性分别为95%、91%、89%。氨基酸序列分析发现,存在1个10个肽的核定位信号序列19-PASPKRRRCA-28,推测的氨基酸序列的二级结构中含有2个a-螺旋。在重建的系统进化树上,几个不同物种的akirin2蛋白分成3支,结果表明猪akirin2与人、牛和羊的亲缘关系比其与小鼠和大鼠的近,与鸡的亲缘关系最远。

猪LIAS基因微环表达载体的构建

为了构建猪LIAS基因长期高效的表达载体,本研究通过RT-PCR方法从猪肌肉组织中克隆了LIAS基因片段,并将该基因片段与微环表达载体minicircle进行连接,构建成微环载体minicircle-LIAS,然后转染HeLa细胞,检测其在HeLa细胞中绿色荧光蛋白的持续表达时间。结果表明,本研究克隆了猪LIAS基因,该基因长度为1 119bp,并将该基因成功构建到了微环表达载体minicircle上;转染HeLa细胞对绿色荧光蛋白持续表达时间的观察显示,构建的微环表达载体minicircle-LIAS中绿色荧光蛋白的持续表达时间明显高于常用的pEGFP-N1质粒,为进一步阐明LIAS合成的生化过程及功能调控提供了新思路和试验材料。

猪AQP11基因微环表达载体的构建

旨在构建猪AQP11基因高效表达载体,观察该载体转染Hela细胞的转染效果。本研究通过PCR方法从猪肠道黏膜组织中克隆AQP11基因,构建了微环表达载体minicircle-AQP11,通过瞬时转染Hela细胞观察绿色荧光蛋白表达。结合测序结果表明,本研究成功地克隆了AQP11基因的全序列,包含了完整的CDS区,构建了AQP11基因的微环表达载体,在Hela细胞中观察到了持续1周的绿色荧光蛋白表达。这为进一步阐明AQP11合成的生化过程及功能调控提供新思路。

靶向akirin2基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效率的测定

为了抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达,试验采用siRNA表达载体法构建了靶向akirin2基因的RNA干扰(RNAi)真核表达载体。首先针对akirin2基因设计并合成了相应的干扰序列,退火后将其与RNAi表达载体psiRNA-h7SKGFPzeo进行连接,构建成干扰载体akirin2-pshRNA0、akirin2-pshRNA1。将构建好的载体通过Turbofect转染试剂转染小鼠成肌细胞C2C12,通过荧光定量PCR检测其干扰效率,经酶切和测序鉴定所构建的akirin2基因RNA干扰载体与设计序列完全相符。结果表明:重组干扰载体akirin2-pshRNA0和akirin2-pshRNA1构建成功。将重组RNAi载体转染C2C12细胞,与正常对照组相比,转染akirin2-pshRNA1组的akirin2基因mRNA相对表达量显著降低,表达量下调了60.62%(P<0.05)。说明试验构建的靶向akirin2基因的RNAi载体akirin2-pshRNA1可以有效地抑制C2C12细胞中akirin2基因的表达。

猪SCD基因启动子的克隆构建

硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-CoA Desaturase,SCD)基因在猪的不同的组织中均有分布,高热量饮食、运动、激素等因素均会影响其基因表达水平。对SCD基因表达水平和蛋白活性的调控会直接影响猪肌肉和脂肪组织中的饱和与不饱和脂肪酸的比例,从而进一步影响机体的脂肪代谢。试验从仔猪肝脏组织中提取基因组DNA,设计含有MluI和BglII酶切位点的引物。

猪硫辛酸合成酶基因真核表达载体的构建

a-硫辛酸含有双硫五元环结构,其作为一种独特的氧化还原脱氢酶--线粒体酶系复合物的辅助因子,参与机体的葡萄糖氧化和ATP生成,在生物体内可转化为还原型二氢硫辛酸,而硫辛酸合成酶(Lipoic Acid Synthase,LIAS)可在细胞内调控α-硫辛酸的合成。试验首先从仔猪肝脏组织中提取RNA,反转录成cDNA,分别设计引物,在引物的两端加入含有EcoRI。