甘蓝中硫氧还蛋白编码基因THL1的分子特性及表达研究

采用PCR和RT-PCR技术,以‘E1’甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对THL1基因进行扩增克隆,得到的片段长度分别为732bp和455bp。序列分析表明,克隆的DNA和cDNA序列与甘蓝‘西园四号’THL1的DNA和cDNA同源性分别为97.9%和98.3%,两条序列内含子的大小不同;同时,前者第2内含子不符合典型的GT-AG规则:即第2个内含子3′端碱基为AT。将THL1基因cDNA序列定向克隆到原核表达载体pET-43.1a(+),构建融合表达质粒pET43.1a(+)-THL1,在大肠杆菌BL21中表达出分子量为74kD的融合蛋白,经胰岛素检测,THL1有氧化还原活性,表明THL1在大肠杆菌中得到了正确表达。

甘蓝自交不亲和信号传导中THL1和SRK相互作用的体外检测

在甘蓝自交不亲和信号传导中SRK和THL1之间可能存在相互作用。为进一步证实该相互作用,以甘蓝E1为材料,采用RT-PCR技术扩增了THL1和SRK激酶结构域(记为SRKE1)编码序列,构建了THL1原核表达质粒pET43.1-THL1,SRKE1原核表达质粒pET431-SRKE1和真核表达质粒pPIC9K-SRKE1,分别在宿主菌大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达。THL1融合蛋白经胰岛素检测,表明表达的THL1有氧化还原活性。建立了体外检测蛋白质相互作用的新方法,并用该方法对THL1与SRKE1的相互作用进行了检测,结果表明THL1可与SRKE1相互作用并形成稳定的复合体,这为深入分析THL1与SRK相互作用机理提供了理论和技术基础。

基于SRK和SCR序列的甘蓝自交不亲和系单倍型分析

采用RT-PCR和其他分子生物学方法,以甘蓝自交不亲和系E1和F1柱头cDNA为模板扩增SRKE1和SRKF1基因,以花药cDNA为模板扩增SCRE1和SCRF1基因.经序列比对首次证明E1和F1材料分别为S28和S7单倍型.经三维结构分析,预测SCRE1上C5-C6和C7-C8之间氨基酸序列决定SCRE1的单倍型特异性,SRKE1上TNNSFYSRLKVS序列决定了SRKE1的单倍型特异性,并对两者相对作用的关键氨基酸位点进行了分析.

析《园艺植物育种学》教学改革

结合《园艺植物育种学》教学实践和教学改革中的体会,总结指出通过以下几个方面改革能够有效地提高教学质量:(1)注重主讲教师选拔,构建合理教学团队;(2)完善课程体系,优化教学内容;(3)改进教学手段,完善教学方法;(4)重视实验教学,提高学生综合能力;(5)加强强网络课件建设,拓宽学生学习渠道。

中西医结合治疗视神经炎62例

目的:观察采用中西医结合的方法治疗视神经炎的疗效。方法:根据病程将视神经炎分为早、中、晚三期,分期辨证论治应用中药,并静脉及局部应用西药治疗,经中西医治疗2个月后统计疗效。结果:视神经炎62例(77只眼),治愈43只眼,好转22只眼,无效12只眼,总有效率84.42%。结论:治疗上紧扣火、郁、虚病之本,或清肝解郁,或滋阴降火,或补益气血,注意活血化瘀的运用,中西结合,疗效显著。

魔芋软腐病和白绢病及其综合防治技术

软腐病和白绢病是魔芋的两种主要病害 ,主要在 6～ 9月流行 ,在我国的各魔芋产区普遍发生 ,危害较重。该文主要介绍这两种病害的症状、病原及发病规律和综合防治技术。

甘蓝BoExo70A1与BoSEC3、BoExo84蛋白相互作用的酵母双杂交检测

Exo70A1是芸薹属作物柱头接受亲和花粉的必需因子,可能参与了干性柱头水分分泌和花粉水合过程。本文从自交不亲和甘蓝A1柱头c DNA中获取了Bo Exo70A1、Bo SEC3、Bo SEC10、Bo SEC15和Bo Exo84基因的编码序列,序列分析表明,Bo Exo70A1、Bo SEC3、Bo SEC10、Bo SEC15和Bo Exo84基因分别与At Exo70A1、At SEC3A、At SEC10、At SEC15B和At Exo84B基因的c DNA序列高度同源,其编码的5个蛋白均没有信号肽,Bo SEC3蛋白含有一个典型的EF-hand钙离子结合结构域。将Bo Exo84蛋白拆分为2个片段(Bo Exo84-N和Bo Exo84-C),并与Bo SEC3、Bo SEC10和Bo SEC15蛋白编码序列一起分别亚克隆至p GADT7质粒,Bo Exo70A1蛋白编码序列亚克隆至p GBKT7质粒,酵母双杂交检测结果表明,Bo Exo70A1蛋白能与Bo SEC3、Bo Exo84-N蛋白互作,但不能与Bo SEC10、Bo SEC15蛋白互作,这为深入探讨Bo Exo70A1蛋白乃至整个胞泌复合体在甘蓝干性柱头接受自花花粉排斥异花花粉过程中的作用机制提供了依据。

中西医结合治疗急性化脓性眼内炎42例

目的 :观察中西医结合疗法对急性化脓性眼内炎的疗效。方法 :采用中药汤剂和抗生素治疗与常规应用激素和抗生素治疗对照观察。结果 :治疗组 4 2例 ,有效率为 92 86% ;对照组34例 ,有效率为 73 53% ,P <0 0 5。结论 :中西医结合疗法的疗效明显优于常规疗法 ,中药完全可以取代激素 ,以减轻其毒副作用 ,尽可能地挽救患者的视力 。

^(60)Co-γ射线辐射对花魔芋性状影响初探

为了探索魔芋新的育种途径,采用不同剂量的60Co-γ照射已萌动花魔芋球茎,栽植后出现矮化、黄化、蕨叶、白化、叶色深绿的性状变异植株。同时,初步得到照射花魔芋半致死剂量LD50为1.5KR。

甘蓝自交不亲和基因MLPK与SSP的FISH定位

利用FISH技术,对自交不亲和基因MLPK与SSP在甘蓝有丝分裂前中期染色体、减数分裂早粗线期染色体以及伸长DNA纤维等3种分辨率水平的靶DNA载体上进行物理定位。结果表明,在有丝分裂前中期,MLPK探针信号位于一对近中着丝粒同源染色体的短臂中部,距着丝粒的百分距离约为53.41±3.16;SSP探针信号位于一对具有随体的近端着丝粒同源染色体的长臂端部,距着丝粒的百分距离约为78.36±4.26。综合3种载体上的FISH结果表明,MLPK与SSP在甘蓝染色体组中可能都只有一个同源序列座位,具有在单倍体基因组中的单拷贝性。重复FISH杂交表明,MLPK与5SrDNA位于同一对染色体。依据Armstrong的核型分析标准,初步判断MLPK与SSP可能分别位于甘蓝的2号和7号染色体,与S位点不存在连锁关系。另从比较基因组学角度对定位结果进行了讨论。

结球甘蓝SRK-ARC1-Exo70A1互作域的确定及作用强度

【目的】深入研究甘蓝自交不亲和信号传导关键元件S-位点受体激酶SRK与臂重复蛋白ARC1及ARC1与Exo70A1间相互识别的分子机理,鉴定SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1之间的互作区段,并分析其作用强度,明确蛋白间互作功能域。【方法】通过生物信息学分析得到蛋白功能域,根据分析结果以典型的自交不亲和结球甘蓝E1为材料分别扩增SRK、ARC1和Exo70A1含不同功能域的截短体片段,利用分子克隆技术将SRK激酶域(SRKj)及其截短体SRKjΔ1—SRKjΔ4,Exo70A1全长及其截短体Exo70A1Δ1—Exo70A1Δ3的编码序列分别亚克隆至p GADT7(AD)质粒,将ARC1及其截短体ARC1Δ1—ARC1Δ8的编码序列分别亚克隆至载体p GBKT7(BD)质粒。用PEG/Li Ac法将获得的AD和BD重组质粒两两组合分别共转化到酵母AH109感受态中,观察融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT平板上的菌落生长情况和颜色变化情况,进一步测定其β-半乳糖苷酶活性。最后通过原核表达体外孵育检测蛋白质相互作用的方法对SRK-ARC1及ARC1-Exo70A1的相互作用进行验证。【结果】DNA测序和内切酶分析显示成功构建18个酵母双杂交表达载体,且无自激活能力。在SRK-ARC1的10个试验组合中,只有ARC1Δ4、ARC1Δ8、ARC1与SRKj组合的融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1。随着SRKj或ARC1截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性逐渐增加,其中,ARC1Δ4与SRKj组合的β-半乳糖苷酶活性最高(酶活为15.98)。在ARC1-Exo70A1 16个试验组合中,Exo70A1Δ3与ARC1Δ1Δ3都相互作用,其融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 m M 3-AT培养基上长出蓝色菌落,激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1。随着ARC1或Exo70A1截短体片段的延长,二者的β-半乳糖苷酶活性呈现先增加后降低的趋势,其中ARC1Δ2与Exo70A1Δ3组合的β-半乳糖苷酶活性最大(酶活性为25.07)。说明ARC1的N端和Exo70A1的N端发生了互作,而ARC1的C端、全长与Exo70A1都不发生互作。体外表达检测蛋白相互作用发现,SRKj与ARC1Δ4、ARC1Δ2与Exo70A1Δ3均可以直接发生相互作用。【结论】SRK的激酶域(SRKj)与ARC1的C端臂重复区发生互作,缩短SRK激酶域中的任何结构域或者缩短ARC1的臂重复区,二者都不会发生互作。ARC1的亮氨酸拉链和蜷曲螺旋与Exo70A1的N端结构域(去除pfam Exo70A1域)介导了二者的相互作用。SRK-ARC1的作用力强度小于ARC1-Exo70A1的作用力强度。

白魔芋多倍体诱导研究初报

采用种子浸泡法和根状茎顶芽滴液法进行白魔芋多倍体诱导,比较了不同秋水仙素浓度和不同处理时间对出苗率和变异率的影响。结果表明,滴液法对材料的毒害性更小,经同一浓度秋水仙素溶液处理后出苗率和植株形态变异率均高于种子浸泡法,但诱变加倍的效果不如浸泡法。实验中获得一株纯合四倍体植株,由0.20%秋水仙素溶液处理种子48h诱变得到。

甘蓝自交不亲和信号传导元件ARC1的体外表达及其与SRK相互作用验证

在甘蓝自交不亲和信号传导中ARC1和上游因子SRK之间可能存在相互作用。为进一步证实该相互作用,以甘蓝E1为材料,采用RT-PCR技术扩增ARC1的编码序列,构建ARC1原核表达质粒pET43.1a-ARC1,转化宿主菌大肠杆菌BL21,通过SDS-PAGE检测该蛋白的表达。利用免疫共沉淀原理及pET43.1a-ARC1融合蛋白序列中的6×His标签与Ni+结合的特点建立了体外检测蛋白质相互作用的新方法,并用该方法对ARC1与SRK的相互作用进行了检测。结果表明,在体外ARC1能与SRK相互作用并形成复合体,这为深入分析ARC1与SRK相互作用机理以及探讨ARC1与下游传导元件的相互作用提供了理论和技术基础。

甘蓝自交不亲和信号转导元件ARC1与EXO70A1的相互作用

从甘蓝型油菜与羽衣甘蓝柱头中克隆出ARC1与EXO70A1基因的编码区,序列分析显示推导的甘蓝型油菜ARC1比羽衣甘蓝ARC1少编码2个氨基酸,ARC1蛋白在羽衣甘蓝与甘蓝型油菜中存在45个氨基酸的差异,其序列相似度与一致性分别达到95.9%和93.9%;推导的EXO70A1在2种植物中仅有6个氨基酸的差异,其序列相似度与一致性分别达到99.4%和98.9%;EXO70A1蛋白在种内和物种间都保持着高度的保守性,其保守的程度高于ARC1。应用酵母双杂交系统检测2种蛋白质的相互作用,发现在二倍体酵母细胞中,全长的ARC1与EXO70A1之间存在较强的相互作用,能激活4个报告基因(ADE2、HIS3、AUR1-C和MEL1)的表达;去除C-端(包括臂重复区)316个氨基酸残基后的ARC1N与EXO70A1之间表现出较弱的相互作用,只能激活3个报告基因(ADE2、AUR1-C和MEL1)的表达,表明ARC1的臂重复区可能并不位于ARC1与EXO70A1的互作界面的核心区段,ARC1的N-端结构域对ARC1与EXO70A1互作起关键作用;同时发现不同ARC1-EXO70A1组合的互作强度相当,其可能原因是ARC1和EXO70A1在甘蓝与甘蓝型油菜中存在的这些序列差异并未影响ARC1-EXO70A1互作界面的构象。

常压页岩气全电动压裂装备及技术示范应用效果分析

常规压裂装备存在效率低、环境污染大以及国内市场水功率保障不足等问题,不能满足国内页岩气开发扩大化和促进产能提升的需求,因此,推荐在页岩气压裂工程中应用全电动压裂装备。通过重点分析全电动压裂装备及技术在常压页岩气资源区块示范应用效果,论证其在页岩气效益开发和绿色低碳发展方面的优势,结果表明:全电动压裂装备能稳定实现高负载、高可靠和连续大排量施工,且施工效率高。相比燃油压裂装备,可节约施工设备、动力、人工以及维护等方面的综合成本40%以上,污染排放总量减少70%,有效控制厂界噪声,有利于推动实现常压页岩气效益开发和建设绿色矿山企业。

甘蓝、大白菜和甘蓝型油菜EXO70A1基因的克隆与表达特性

从甘蓝、大白菜与甘蓝型油菜中分离出EXO70A1基因,对该基因的序列进行生物信息学分析,然后转化酵母Y187,应用半定量RT-PCR检测BoEXO70A1基因的表达特性。结果表明,3种芸薹属植物EXO70A1编码序列长度均为1917bp,相似性97.1%,它们的gDNA序列均为单一序列,长度分别为3797、3752和3770bp,一致度达91.0%,均由12个外显子及11个内含子组成,除了第4、第5、第6、第8个内含子外,其余内含子的保守性低于外显子;推导的3种蛋白质序列(BnEXO70A1、BrEXO70A1和BoEXO70A1)的相似度与一致性分别达99.8%与98.1%,其二级结构、三维结构及理化特性高度相似。EXO70A1基因的11个内含子的剪切位点均符合"GU-AG"法则,剪切受体(AG)的前20～50个碱基存在一段保守的序列"CU(A/G)A(C/U)";3种芸薹属植物与拟南芥EXO70A1基因的12个外显子的对应序列长度完全相同,所构成的编码区的序列一致性达90.1%,相应的蛋白质序列的相似度与一致性分别达99.8%与93.7%;分子进化分析表明,EXO70A1在整个EXO70蛋白家族中及不同的植物间表现出较高的保守性;BoEXO70A1在酵母细胞Y187呈现弱表达;EXO70A1在甘蓝的雄蕊、幼茎、幼嫩花瓣、雌蕊、幼根及叶片中均能表达,可能属于组成型表达基因,但是其表达量在不同发育时期的不同器官中存在差异,授粉前雌蕊中最高,雄蕊中最低。由此可知,EXO70A1在芸薹属植物中整体高度保守,但在酵母转化株和甘蓝各器官中的组成型表达有所差异,推测EXO70A1在植物细胞中具有多种重要的功能。

甘蓝ROH1与EXO70A1的表达与相互作用

【目的】以自交不亲和材料甘蓝为研究对象,分析ROH1的组织表达、ROH1与EXO70A1的相互作用及其是否参与甘蓝生殖发育。【方法】从甘蓝花蕾中克隆出ROH1和EXO70A1,应用半定量RT-PCR检测ROH1的表达特性;应用实时荧光定量PCR进一步分析甘蓝授粉后1 h内ROH1和EXO70A1的表达量和二者的相关性;分别构建以p GBKT7为载体的EXO70A1重组"诱饵"质粒和以p GADT7为载体ROH1的重组猎物质粒,并将重组质粒转化酵母菌株,利用缺陷型培养基进行蛋白质相互作用检测,确定ROH1和EXO70A1是否存在相互作用。【结果】在甘蓝中ROH1为单外显子基因,编码含398个氨基酸残基的蛋白质,与拟南芥ROH1对比发现,甘蓝ROH1序列内存在一个连续16个氨基酸残基的缺失;它在甘蓝的雄蕊(花药)、花柱、幼茎、幼根及叶片中均有表达但表达量差异明显,其中,在幼叶、花柱和雄蕊(花药)中的表达量较高,在幼根和幼茎中的表达量较低;甘蓝授粉后柱头中ROH1的表达量在1 h内呈现出"上升-下降-上升"趋势,其中,以授粉后30 min的表达量最低,授粉后1 h的表达量达到最高值;而EXO70A1在授粉后1 h内的表达呈现出"下降-上升"的趋势,并以授粉15 min时表达量最低,授粉后1 h时的表达量最高;二者表达的动态变化说明ROH1和EXO70A1参与了甘蓝的生殖发育;ROH1与EXO70A1的表达量趋势线呈现出负相关性,并在30 min时出现了重叠区域,预示ROH1与EXO70A1之间可能存在相互作用;成功构建p GADT7-ROH1和p GBKT7-EXO70A1酵母表达载体,通过酵母双杂交试验,发现载体p GBKT7-EXO70A1无自激活能力,融合菌株同时激活4个报告基因(AUR1-C、MEL1、HIS3和ADE2)的表达,表明花药中ROH1和花柱中的EXO70A1之间存在较强的相互作用。【结论】甘蓝的ROH1和EXO70A1之间存在较强的相互作用并呈现出负相关性,ROH1可能通过调节EXO70A1在柱头的分泌影响生殖发育。

结球甘蓝叶片卷曲过程中6个生长素相关基因的克隆与表达分析

生长素在结球甘蓝球叶向上、向内自然卷曲的过程中发挥着重要的调控作用。为挖掘重要的影响结球甘蓝叶片卷曲的生长素相关基因,通过对结球甘蓝莲座期叶片与结球期叶片的转录组进行对比分析,筛选出6个显著差异表达的生长素相关基因,分别为调控生长素动态平衡的Bo ILL6、Bo ASA1基因,控制极性运输的Bo SF21、Bo PIN4基因,参与信号转导的Bo ARF8、Bo GH3.5基因。对上述6个基因进行同源克隆,分别获得全长c DNA序列,序列分析发现6个基因均含有生长素相关的结构域。分子进化树分析发现各基因与芜菁的对应基因遗传关系最近,拟南芥次之。荧光定量PCR检测结果显示,Bo ILL6、Bo ASA1与Bo SF21的表达量变化最为显著,结球期叶片相对莲座期叶片的表达量差异均高达12倍以上,变化趋势与转录组数据分析结果基本一致,说明这3个基因可能与结球甘蓝叶片的卷曲发育密切相关。