UPLC-MS/MS测定牛血浆中加米霉素方法的建立

建立牛血浆中加米霉素含量的UPLC-MS/MS检测方法。血浆样品经甲醇沉淀蛋白,外标法定量,使用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱,以甲醇:10 mM乙酸铵缓冲液为流动相,流速0.3 mL/min;柱温:50℃;进样量:10μL。三重四级杆质谱仪电喷雾离子源(ESI),正离子扫描、多反应监测(MRM)。考察方法的线性范围、准确度与精密度、稳定性和稀释可靠性。结果显示,加米霉素出峰时间在1 min左右,本方法在1~100 ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数r≥0.999,检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.5 ng/mL和1 ng/mL。3个浓度(1、50和100 ng/mL)的空白血浆添加样品批内和批间平均回收率分别在85.23%~95.63%和87.73%~93.97%之间,相对标准偏差(RSD)分别在1.402%~13.92%和2.903%~8.680%之间。准确度和精密度、稳定性及稀释可靠性均符合生物样品分析的相关要求。本方法可用于牛的血浆中加米霉素的浓度测定及药代动力学研究。

荚膜甲基球菌蛋白遗传毒性研究和被动皮肤过敏试验

荚膜甲基球菌蛋白(Methylococcus capsulatus bacteria meal,MBM)拟开发为新饲料原料。本研究旨在通过遗传毒性研究和被动过敏试验评价其毒理学安全性,为其未来的应用奠定基础。本研究包括四个试验:鼠伤寒沙门氏菌回复突变(Ames)试验采用平板掺入法,每皿剂量在0.625~10.000 mg范围内,采用TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535五种菌株进行回复突变试验;小鼠骨髓细胞微核试验和精子畸形试验均设2500、5000、10000 mg/kg三个MBM剂量组,微核试验采用30 h两次给药法,精子畸形试验连续染毒5 d,分别在既定的时间采样制片;大鼠被动皮肤过敏试验设250、500、1000 mg/kg三个MBM剂量组,制备抗血清后背部皮内注射致敏,24 h和/或48 h后进行抗原激发,考察蓝色反应斑直径。所有试验均根据要求设置阴性、阳性对照组。结果表明:在有或无代谢活化系统结果(S9)时,MBM的鼠伤寒沙门氏菌回复突变(Ames)试验结果均为阴性;小鼠骨髓细胞微核和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠皮肤被动过敏试验结果为阴性。说明在设置的试验系统和剂量下MBM未显示遗传毒性和潜在的致敏性。

高效液相色谱法测定鸡血浆中帕托珠利和托曲珠利含量研究

为建立一种测定鸡血浆中帕托珠利和托曲珠利含量的高效液相色谱法,试验采用C18色谱柱,分别以0.2%乙酸水-乙腈(47∶53)和0.02 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH 3.0)-乙腈(40∶60)为流动相,柱温分别为35℃和30℃,流速为1 mL/min,紫外检测器检测,检测波长分别为250 nm、240 nm,外标法定量建立检测方法。结果显示,帕托珠利和托曲珠利的浓度与色谱峰面积在0.10~20.00μg/mL浓度范围内线性关系良好(R2>0.999),帕托珠利平均加样回收率为89.65%~96.12%,托曲珠利平均加样回收率90.84%~94.27%,批内和批间变异系数均小于5%。结果表明,建立的高效液相色谱法简便、有效、重现性良好,可用于鸡血浆中帕托珠利和托曲珠利含量的测定。

荚膜甲基球菌蛋白的急性毒性和亚慢性毒性研究

为评价荚膜甲基球菌蛋白(MBM)急性与亚慢性毒性,进行在大、小鼠的急性经口毒性试验和大鼠的90 d亚慢性毒性试验。急性毒性试验将大、小鼠各40只,分别随机分为对照组和给药组,给药组剂量为10 g/kg·bw,对照组灌胃相等体积的溶媒。给药后连续观察14 d,于第15天进行大体剖检。亚慢性毒性试验将80只大鼠,随机分为高、中、低剂量组和对照组,分别饲喂添加5%、2.5%和1%MBM的饲料和空白饲料,连续90 d。试验期间每天进行观察,每周记录体重、摄食和饮水量,于试验第45天和90天每组随机采血10只大鼠后进行病理学检查并摘取指定脏器计算脏器系数,血液用于血液学和血液生化检查。结果显示:急性毒性试验中除因操作不当导致一只小鼠死亡外,观察期内未见中毒症状与动物死亡,大体剖检各脏器组织均无异常;亚慢性毒性试验期间除计划剖检外动物均存活且无中毒症状,虽有个别指标与对照组存在统计学差异,但与MBM毒性无关,病理学检查亦未见病变。结果表明MBM在大、小鼠LD50均≥10 g/kg·bw;添加5%MBM于饲料中未观察到明显的有害作用,无作用剂量至少达到3100 mg/kg·bw。

海南霉素钠预混剂对鸡毒害艾美耳球虫的效力试验

为评价海南霉素钠预混剂对鸡毒害艾美耳球虫的疗效,采用人工感染的方式,选用180只鸡健康雏鸡,随机分为5组,每组30只。除不感染不给药组外,每组鸡均经嗉囊感染毒害艾美耳球虫孢子化卵囊2×10^4个。受试药物与对照药物均经混饲给药,海南霉素钠浓度为7.5mg/kg,莫能菌素浓度为100mg/kg,地克珠利浓度为1mg/kg,给药持续时间为10d,期间动物均自由采食。结果显示:海南霉素钠预混剂在防治爆发性球虫病时有良好效果,综合其对鸡人工感染毒害艾美耳球虫的临床症状(血便)、病变损害和卵囊的控制及增重等影响,海南霉素钠预混剂按推荐剂量7.5mg/kg连续使用10d,对鸡毒害艾美耳球虫有较好的疗效。

杆菌肽在动物可食性组织和禽蛋中残留的HPLC-MS/MS检测方法

建立动物(猪、鸡、鸭)可食性组织(肌肉、肝脏、肾脏、脂肪)和禽蛋(鸡蛋、鸭蛋)中杆菌肽的高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)检测方法。使用0.1%甲酸水溶液提取样品中的杆菌肽,三氯乙酸乙腈沉淀蛋白,正己烷除脂,混合阳离子型固相萃取柱净化后,进HPLC-MS/MS检测。待测物使用C_(18)色谱柱分离,以0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱(乙腈:0~0.5 min 15%,5.0~5.5 min 85%,5.6~6.5 min 15%);质谱采用电喷雾离子源(ESI),正离子扫描,多反应监测(MRM)模式进行检测,外标法定量。结果显示:在50~1000 ng/g的添加范围内,各组织中杆菌肽添加浓度与目标峰面积的线性关系良好,相关系数均大于0.999。猪、鸡、鸭的可食性组织及禽蛋在50、100、500、750 ng/g的添加浓度下,平均回收率分别为71.3%~80.1%、71.6%~80.7%、71.5%~84.7%和66.2%~80.9%,批内、批间变异系数均小于15%。试验建立的动物可食性组织和禽蛋中杆菌肽残留的HPLC-MS/MS检测方法满足动物可食性组织中杆菌肽残留限量的检测要求。

基于PK/PD模型对恩诺沙星可溶性粉在鸡混饮给药方案的药效再评价

旨在对不同日龄雏鸡开展恩诺沙星可溶性粉混饮给药的药动学研究,并利用获得的药动学参数通过PK/PD模型结合Monte Carlo模拟(Monte Carlo simulation,MCS)评价恩诺沙星可溶性粉推荐给药方案的合理性。分别在1、7和14日龄雏鸡进行恩诺沙星可溶性粉75 mg·L^(-1)(以恩诺沙星计)混饮给药,按预定时间点采集血样,采用经验证的HPLC法测定各时间点每只鸡的血药浓度,拟合药动学参数。将获得的药动学参数与美国临床和实验室标准协会(CLSI)给出的恩诺沙星对禽大肠杆菌的敏感性折点值(0.25μg·mL^(-1))结合计算PK/PD参数,并通过MCS获得当前给药方案在大肠杆菌不同MIC分布下的达标率(target attainment rate,TAR)。结果显示,1、7和14日龄雏鸡3个处理组在第0天达峰浓度(C _(max))分别为0.561、0.564和0.550μg·mL^(-1),24 h曲线下面积(AUC _(0-24))分别为8.85、9.85和9.27μg·h·mL^(-1);3个处理组给药第4天C _(max)分别为0.599、0.550和0.487μg·mL^(-1),平均稳态血药浓度(C_(avg))分别为0.513、0.493和0.432μg·mL^(-1),AUC _(0-24)分别为12.31、11.82和10.37μg·h·mL^(-1),C _(max)/MIC分别为2.40、2.20和1.95,C_(avg)/MIC分别为2.05、1.97和1.73,AUC _(0-24)/MIC分别为49.24、47.28和41.48。恩诺沙星对MIC≤0.25μg·mL^(-1)的大肠杆菌临床分离株,1、7和14日龄雏鸡给药期间TAR为75.01%~76.11%。以上结果表明,恩诺沙星可溶性粉按目前的推荐给药方案对敏感菌PK/PD参数比值和TAR均达不到预期,不仅杀菌效果有限,且易诱导细菌产生耐药性。

口服帕托珠利溶液在鸡体内的生物利用度及其与托曲珠利溶液的药动学比较研究

为研究帕托珠利溶液口服给药在健康肉鸡的药动学特征和生物利用度,并与其前体药物托曲珠利溶液在鸡口服给药进行药动学比较,试验将30只健康肉鸡(公母各半,平均体重约为1.55 kg)随机分为三组,分别为帕托珠利溶液口服组(5 mg/kg bw)、帕托珠利溶液静注组(5 mg/kg bw)和托曲珠利溶液口服组(5 mg/kg bw)。所有受试动物于给药后按规定时间点采集血样。血药浓度-时间数据使用Winnolin 8.1.0拟合药动学参数。结果显示:帕托珠利溶液单剂量口服后在鸡体内的平均达峰浓度(C_(max))、达峰时间(T_(max))、半衰期(T_(1/2β))和药时曲线下面积(AUC_(0-t))分别为4.52μg/mL、24.00 h、101.78 h和609.23 h·μg/mL;帕托珠利溶液单剂量静注后在鸡体内的AUC0-t为778.27 h·μg/mL,绝对生物利用度(F)为78.67%;托曲珠利溶液单剂量口服后的平均C_(max)、T_(max)、T_(1/2β)和AUC_(0-t)分别为6.17μg/mL、2.80 h、16.65 h和92.00 h·μg/mL。研究表明,帕托珠利溶液口服吸收良好,在鸡体内分布范围较窄,有较高的体清除率但消除缓慢,比托曲珠利口服吸收C_(max)明显延迟,消除半衰期显著延长。

帕托珠利混悬液对靶动物仔猪的安全性评价

为研究帕托珠利混悬液对靶动物仔猪的安全性,本试验选取32只3~5日龄哺乳仔猪,分为4个剂量组,每组8头,公母各半。其中各剂量组按体重给药剂量分别为1倍(15 mg/kg)、3倍(45 mg/kg)和5倍(75 mg/kg)最大推荐剂量,经口灌服5%帕托珠利混悬液,连用3次,每次间隔3 d;另一组为空白对照组,给予相当于5倍最大推荐剂量体积的生理盐水,试验周期为17 d。试验期间除进行一般临床健康状况观察外,还进行体重增重、体温、血常规和血液生化指标检测,以及大体剖检和组织病理学检查。结果显示,试验期间试验组和对照组临床表现正常,帕托珠利混悬液各剂量组对仔猪的精神状态、生长性能、血常规、血液生化指标均无明显影响,均处正常范围内。对5倍推荐剂量组及对照组的仔猪进行剖检,主要脏器和显微结构未见明显异变,未出现中毒及死亡。研究表明,推荐剂量下帕托珠利混悬液口服给药对靶动物仔猪有较大安全性。