儿童急性呼吸道博卡病毒感染

了解博卡病毒（Human Bocavirus，HBoV）在我国儿童急性呼吸道疾病中的感染情况。采用PCR扩增的方法对2005年10月～2006年1月收集的72例急性呼吸道感染的住院儿童鼻咽抽吸物（nasopharyngeal aspirates，NPA）进行了HBoV基因检测。将PCR阳性产物进行TA克隆，测序，并将所测序列与GenBank中HBoV序列进行比较分析。72份标本中共检测到6份HBoV阳性扩增产物，阳性率为8．3％（6／72），该6例HBoV刚性患儿临床均有肺炎或支气管肺炎症状。由此可以初步看出HBoV可能也是儿童急性呼吸道感染中较为重要的一个病原，且可能与儿童急性下呼吸道感染存在相关性。

环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)在丙型肝炎病毒基因检测中的应用

该文介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增基因检测技术，该技术分别使用特异对应于靶序列中8个基因区段的3对特殊引物，并在反转录酶和Bst-DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应，整个检测反应只需1～2h。利用这种技术成功检测了丙型肝炎病毒基因，对60份经Real-timePCR或RT—-PCR验证阳性的血清样品检测，阳性符合率为98％。同时，对扩增终产物进一步进行酶切分析，并与HIV、HBV和不同亚型流感病毒RNA进行交叉反应和特异性测试，均与预期结果吻合。将Real-timePCR定量后的RNA系列稀释后对检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示，该技术的检测灵敏度在理论上可达到10个拷贝的RNA分子。以上结果证明，RT-LAMP扩增技术是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测手段，在丙型肝炎病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力。

逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用

建立一种便捷、灵敏的检测方法,即逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)用于H5N1亚型禽流感病毒基因检测。该技术使用特异对应于靶序列中8个基因区段的6条特异引物,在等温条件下进行核酸扩增反应。对51份实验感染动物及病毒培养标本的H5N1亚型禽流感病毒的HA、NA基因区进行了RT-LAMP检测,并以SYBR Green I为反应指示剂进行了逆转录环介导等温核酸扩增技术,对该反应进行实时监控,经对扩增产物做内切酶验证和测序分析,证明RT-LAMP技术的特异性;同时,用10倍系列稀释的RNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示:利用RT-LAMP技术成功检测到H5N1禽流感病毒的HA、NA基因区,且RT-LAMP与Real-time PCR结果呈现很好的一致性。此方法的灵敏度可达到能检测10个拷贝RNA分子水平。因此,RT-LAMP技术应用于H5N1亚型禽流感病毒的快速检测是一种可行的方法。

中国内陆发现HCoV-HKU1感染及N和S蛋白基因序列及进化分析

了解冠状病毒HKU1在我国大陆地区的感染情况及N基因和S基因的编码特征。采用RT-PCR的方法对2005年10月～2006年1月收集的260例急性呼吸道感染的住院儿童鼻咽抽吸物（NPA）进行了冠状病毒HKU1基因检测。将PCR阳性产物测序，并将所测序列在GenBank中进行比较分析。260份样本中共检测到2份冠状病毒HKU1阳性，阳性率为0．77％（2／260），且该2例冠状病毒HKU1阳性患者临床均表现为肺炎症状。扩增其中一株病毒N和S全基因，并进行测序，与GenBank中的冠状病毒HKU1参考株及冠状病毒科其它成员进行序列同源性和进化树分析，并对N和S蛋白的结构与功能进行了初步的预测分析。由此表明我国大陆地区存在冠状病毒HKU1感染，且可能与儿童下呼吸道感染存在相关性。

人博卡病毒基因克隆及衣壳编码基因序列变异分析

为了解人博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)VP1基因进化关系;阐明HBoV目前具体的变化规律,用PCR的方法扩增了1株HBoV的全基因和9株HBoV的VP1基因,克隆并测序,在此基础上,将HBoV的全基因序列和衣壳序列分别与细小病毒亚科其他14个有代表性的病毒进行遗传分析,构建进化树,对目前所有可得到的HBoV的17个衣壳蛋白进行二级结构分析和抗原性分析。结果显示:HBoV全基因序列与B19关系较远,但衣壳序列遗传关系较近。以有典型性的猫瘟细小病毒(Feline parvovirus,FPV)衣壳蛋白为参照,分析多个HBoV衣壳序列之间的变异情况,显示HBoV衣壳的二级结构基础表现出较高的保守性,序列之间的变化主要发生在高抗原区域和感染活性区域。衣壳病毒变异情况显示HBoV在稳定自身的情况下表现出一定的活跃性以逃避免疫反应,也表现出一定的感染适应力。

急性下呼吸道感染患儿喘息发生的相关因素分析

目的探讨急性下呼吸道感染患儿发生喘息的危险因素。方法对1 165例急性下呼吸道感染患儿的临床资料进行单因素及多因素Logistic回归分析。结果单因素分析显示急性下呼吸道感染患儿的年龄、是否为特应征体质、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(HRV)感染、性别与喘息发生有关;进一步多因素Logistic回归分析示发病年龄小、特应征体质、RSV、HRV感染、男性为发生急性下呼吸道感染喘息的高危因素。结论对于年龄小、特应征体质、RSV、HRV感染、男性的急性下呼吸道感染患者发生喘息的风险性高,应重点评估及合理控制。

100例重症社区获得性肺炎住院儿童的病毒病原学分析

目的了解重症社区获得性肺炎(CAP)儿童中常见呼吸道病毒的流行特征。方法收集2007年9月至2008年8月诊断为重症CAP的住院患儿鼻咽抽吸物标本100份,采用RT-PCR方法检测呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(HRV)、流感病毒A(IFVA)、流感病毒B(IFVB)、副流感病毒1～3(PIV1～3)、偏肺病毒(hMPV)、冠状病毒NL63(HCoV-NL63)及冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1),PCR方法检测腺病毒(ADV)、博卡病毒(HBoV),巢式PCR方法检测多瘤病毒WU(WUPyV)和多瘤病毒KI(KIPyV),并对阳性标本进行基因测序以证实。结果 100份重症CAP住院患儿鼻咽抽吸物标本中病毒总检出例数为82例(82.0%),其中RSV检出率最高,为37.0%,其次为HBoV 25.0%和HRV 18.0%。病毒总检出率在男女之间差异无统计学意义;HBoV阳性检出率女性高于男性,差异有统计学意义(P<0.05),其他病毒检出率男女比较差异无统计学意义。阳性检出率在各年龄组之间差异有统计学意义(χ2=19.676,P<0.01),尤以0～6月龄组检出率最高。病毒总检出率在四季分布差异有统计学意义(χ2=9.729,P=0.021),以秋冬季检出率最高。有2种及以上病毒协同感染率为32.0%,RSV的协同感染率最高,依次是HBoV、HRV、PIV-3。结论病毒感染是重症CAP患儿的重要病因,其中RSV是最常见病毒病原,其次为HBoV和HRV;病毒检出率以0～6月龄组最高;秋冬季病毒总检出率高于其他季节;且病毒协同感染率较高。

长沙地区急性下呼吸道感染住院儿童人博卡病毒感染的初步研究

目的了解人博卡病毒(HBoV)在长沙地区急性下呼吸道感染住院儿童中的流行情况及临床特征,比较分析其区域流行特点。方法收集2007年9月—2008年3月长沙地区773份急性下呼吸道感染住院儿童鼻咽抽吸物(nasopharyngeal aspirates,NPAs)样本进行HBoV病毒NP1基因检测,将PCR阳性产物测序,并将所测序列在GenBank中进行比较分析。结果 773例样本中,HBoV阳性例数87例,HBoV感染患儿年龄为18 d～64个月,冬春季节流行,主要的临床诊断与症状是支气管肺炎与咳嗽;所测序列与GenBank公布的不同地区的HBoV NP1基因核苷酸序列同源性达99.53%,氨基酸序列同源性达99.8%,对核苷酸序列作基因进化树分析显示属于1种基因型。结论长沙地区部分急性下呼吸道感染儿童与人博卡病毒有关,且HBoV感染在低年龄组的儿童中更常见;一种基因型在长沙地区流行。

螺旋藻POD、CAT和SOD同工酶的研究

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对毛乌素沙地碱湖的钝顶螺旋藻S3和鄂尔多斯螺旋藻S4与国外引进的钝顶螺旋藻S1和极大螺旋藻S2 的POD、CAT和SOD同工酶进行了比较研究。结果表明 :4个样品的 3种酶同工酶带数目不同 ,依次是S4 >S3>S1>S2 ;S3和S4 酶带数多 ,对环境适应性强 ,进化程度较高。螺旋藻不同种间的酶谱相似系数为 0 5 3～ 0 80 ,有较近的亲缘关系 ;原产地不同的钝顶螺旋藻S1和S3间酶谱相似系数最高为 0 86,表明螺旋藻种内差异 <种间差异。

流感病毒神经氨酸酶广谱抑制多肽的筛选研究

以纯化的流感病毒颗粒H1N1、H3N2为靶点对噬菌体展示的随机12肽库进行了筛选。经ELISA、神经氨酸酶抑制活性鉴定,获得52个阳性噬菌体克隆。根据测序和氨基酸序列分析,挑选出不同克隆间同源性最高的6条多肽进行化学合成。神经氨酸酶抑制活性实验显示,6条多肽中54-N1和69-N2的抑制活性最强,对N1、N2和乙型流感病毒三种流感病毒神经氨酸酶均有明显的抑制活性,54-N1的IC50值为7.486~14.693μmol/L,69-N2的IC50值为6.605~13.007μmol/L。同时,54-N1和69-N2可抑制流感病毒在MDCK细胞中的生长。病毒空斑抑制实验显示,54-N1和69-N2可明显抑制空斑形成的大小和数目。通过分析,54-N1的IC50值为18.38-31.76μmol/L,69-N2的IC50值为16.56-25.49μmol/L。两条多肽的浓度在高达10mmol/L时仍对细胞无任何毒性。54-N1和69-N2作为新的流感病毒神经氨酸酶抑制剂,与现有NA抑制剂Oseltamivir进行了比较和讨论,为进一步研制局部应用的广谱抗流感病毒的鼻腔喷雾剂奠定了基础。

新生儿肺炎58例病原学分析

【目的】了解新生儿肺炎病原学分布及临床特点。[方法]对2007年9月至2008年8月本院儿科医学中心住院临床诊断为新生儿肺炎58例患儿，采集鼻咽部分泌物，进行痰细菌培养及呼吸道病毒核酸检测，分析病原学分布及临床特点。【结果】58例患儿39例病毒检出阳性或痰细菌培养阳性，病原检出率67．2％，其中痰细菌培养及呼吸道病毒检出率均为46．6％。痰细菌培养以肺炎克雷伯菌（48．1％）最常见，病毒感染则以RSV（40．7％）及HRV（22．2％）为主。〉7d晚期新生儿较早期新生儿更易发生病毒感染（x^2=6．843，P＝0．009）；病毒感染忠儿较病毒检测阴性患儿更易合并心肌受损（r＝6．416，P＝0．011）。[结论]新生儿肺炎67．2％可明确病原，细菌以肺炎克雷伯菌为主，病毒则以RSV及HRV最常见。呼吸道病毒是新生儿肺炎尤其是晚期新生儿的重要病原，感染者常有心肌受损。

从噬菌体随机肽库中筛选流感病毒神经氨酸酶的抑制多肽

目的:从噬菌体呈现12肽库中筛选与流感病毒神经氨酸酶特异性结合的肽。方法:以甲三型流感病毒裂解疫苗原液为靶分子,经过3轮生物淘选,从噬菌体随机肽库中筛选与之结合的噬菌体。用ELISA方法鉴定噬菌体克隆与靶分子的结合力,用荧光方法测定噬菌体克隆对流感病毒A/Sydney/5/97(H3N2)神经氨酸酶的抑制活性。对筛选到的阳性克隆进行DNA序列测定并推导出相应的氨基酸序列。结果:经过3轮筛选后,42个噬菌体克隆与靶分子有高度亲和力,23个噬菌体克隆对流感病毒A/Sydney/5/97(H3N2)神经氨酸酶有抑制活性。对27个噬菌体克隆的测序结果表明,分别有10个和2个克隆的序列是一致的,其氨基酸序列分别为KSLSRHDHIHHH和WPRHHHSASVQT。结论:通过噬菌体肽库筛选到抑制流感病毒神经氨酸酶的12肽,为进一步研究对流感病毒神经氨酸酶有抑制活性的分子药物奠定了基础。

寨卡病毒E蛋白在重组杆状病毒中的表达

目的 在杆状病毒中表达寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）包膜蛋白（Envelope protein,E蛋白）.方法 人工合成ZIKV E基因全长序列（1 518 bp）,并克隆到pFastBac1载体上,得到重组杆状病毒转移载体pFB1-E,转化含DH10Bac感受态细胞,获得骨架质粒rBacmid-E,转染sf9细胞,得到重组杆状病毒rBac-E.检测病毒滴度,PCR法检测E基因的插入,间接免疫荧光和Western blot法检测E蛋白的表达.结果 经PCR方法鉴定,重组杆状病毒骨架质粒构建成功,重组病毒rBac-E（第3代）病毒滴度为2.58×105pfu/ml.提取感染rBac-E的sf9细胞基因组,经PCR扩增得到3 830 bp的条带,间接免疫荧光检测出现特异性绿色荧光.Western blot鉴定可见感染重组杆状病毒rBac-E的细胞沉淀中在相对分子质量55×103处有特异性条带.结论 在杆状病毒表达系统中重组表达了ZIKV E蛋白,为ZIKV E蛋白功能研究及疫苗的开发奠定了基础.

十二 干扰素诱生剂

干扰素诱生剂是一种能促进干扰素的产生和释放的物质。其种类很多：包括促细胞分裂剂、脂多糖和人工合成的多聚体，如poly I：C和poly A：U（聚腺苷酸-聚尿苷酸）和磷酸多糖；病毒、细菌和寄生虫都被证明可以诱生干扰素，还有许多低分子物质如Tirolone等。在1986年重组人干扰素被美国FDA批准投放市场以前，干扰素诱生剂曾经是研究的热点之一，研究最多的是聚肌胞（poly I：C）。

南京地区2010～2011年度呼吸道感染患儿腺病毒的流行病学研究

本研究为了解南京地区儿童腺病毒(ADV)感染的流行特点及型别,收集2010年8月至2011年7月南京医科大学附属南京儿童医院住院及门诊呼吸道感染患儿的鼻咽抽吸物(NPA)及咽拭子(NPS)共644例,采用巢氏聚合酶链反应法(Nested-PCR)检测ADV hexon基因,将阳性PCR扩增产物进行测序、同源性和进化分析。同时对12种其他呼吸道相关病毒进行PCR检测,包括人博卡病毒(HBoV),呼吸道合胞病毒(RSV),人鼻病毒(HRV),副流感病毒1～4型(PIV1-4),流感病毒A和B(IFVA/B),人偏肺病毒(HMPV),冠状病毒NL63和HKU1(HCoV-NL63和HCoV-HKU1)。结果显示:644例标本中共检出ADV阳性扩增产物171份,检出率为26.55%,3型120例(70.18%,120/171),7型16例(9.36%,16/171),1型12例(7.02%,12/171),2型10例(5.85%,10/171),5型6例(3.51%,6/171),6型3例(1.75%,3/171),57型3例(1.75%,3/171),41型1例(0.58%,1/171)。ADV感染呈全年散发,其发病高峰主要在4～7月。以7岁以下儿童多见(96.49%)。171例ADV感染患儿中有99例(57.89%)存在混合感染,其中以呼吸道合胞病毒(RSV)、人鼻病毒(HRV)多见。ADV阳性患儿诊断以下呼吸道感染为主(63.16%),肺炎占30.41%。结论:ADV是2010年8月到2011年7月南京地区儿童呼吸道感染的重要病原之一,其优势流行株为3型,长期监测其流行型别具有重要意义。

1165例急性下呼吸道感染住院儿童的病毒病原学分析

目的了解长沙地区急性下呼吸道感染(ALRTI)住院儿童中常见呼吸道病毒的流行特点,为本地区儿童ALRTI的防治提供依据。方法收集2007年9月至2008年8月诊断为ALRTI的住院患儿鼻咽抽吸物标本1165份,采用RT-PCR方法检测呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(HRV)、流感病毒A(IFVA)、流感病毒B(IFVB)、副流感病毒1～3(PIV1～3)、偏肺病毒(hMPV)、冠状病毒NL63(HCoV-NL63)及冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1);PCR方法检测腺病毒(ADV)、博卡病毒(HBoV);巢式PCR方法检测多瘤病毒WU(WUPyV)和多瘤病毒KI(KIPyV)。并对阳性标本进行基因测序以证实。结果 1165份标本中有871份检出了病毒,总检出率74.76%,其中RSV最为常见,检出率为27.03%,其次为HRV(17.33%)、PIV3(13.73%)及新发现病毒HBoV(8.67%)和hMPV(6.52%)。病毒总检出率在男女之间差异无统计学意义,但男性PIV3、hMPV和HBoV的阳性检出率高于女性。病毒阳性检出率在各年龄组之间差异有统计学意义(χ2=10.934,P=0.027),以6个月至1岁以内年龄组检出率最高。病毒总检出率在四季分布差异有统计学意义(χ2=12.307,P=0.006),以冬季检出率最高。结论病毒病原在长沙地区儿童ALRTI中占重要地位,其中RSV、HRV及PIV3是主要病毒病原,近年新发现的HBoV和hMPV也占较高比例;病毒检出率以6个月至1岁以内年龄组最高;冬季病毒总检出率高于其他季节。

儿童重症社区获得性肺炎病毒学检测和危险因素分析

目的了解儿童重症社区获得性肺炎病毒病原谱,探讨儿童重症社区获得性肺炎的危险因素。方法收集2007年9月至2008年8月1096例社区获得性肺炎患儿的气道抽吸物标本,其中重症社区获得性肺炎100例。采用RT-PCR、PCR或巢式PCR方法对呼吸道病毒进行核酸检测。应用logistic回归法对患儿的临床相关资料进行单因素和多因素分析,以调查重症社区获得性肺炎的危险因素。结果 100例儿童重症社区获得性肺炎标本中,病毒总检出例数为82例(82%),其中RSV检出率最高(37%),其次为HBoV(25%)和HRV(18%)。2种及2种以上病毒协同感染32例(32%)。Logistic回归分析显示,合并基础疾病及RSV感染为儿童重症社区获得性肺炎发病的危险因素(分别OR=6.623,P<0.01;OR=1.672,P<0.05),月龄为保护因素(OR=0.475,P<0.01)。结论 RSV是儿童重症社区获得性肺炎最常见病毒病原;合并基础疾病及RSV感染是儿童重症社区获得性肺炎发病的危险因素,月龄为保护因素。

南京地区儿童人偏肺病毒感染的流行病学及临床特征分析

目的了解南京地区儿童人偏肺病毒（hMPV）感染的流行病学特点及临床特征。方法收集2009年8月至2010年7月南京医科大学附属南京儿童医院住院及门诊呼吸道感染患儿的鼻咽抽吸物（NPA）及咽拭子（NPS）共642例，采用逆转录聚合酶链反应法（RT—PCR）检测hMPVM基因，将阳性PCR扩增产物进行测序、同源性和进化分析。结果642例标本中共检出hMPV阳性扩增产物35份，检出率为5．5％。系统进化分析显示南京地区hMPVB1型占51．4％，A2b型占31．4％。hMPV的发病高峰在4月份。其致呼吸道感染以1岁以内多见（71．4％）。35例hMPV感染患儿中有15例（42．8％）存在混合感染，其中与HRV的混合感染检出率最高。临床诊断以肺炎（17例，48．6％）最为常见。结论人偏肺病毒是南京地区儿童急性呼吸道感染的重要病原之一，该年度其优势流行型别为B1型，南京地区A、B两型hMPV感染患儿临床特征无明显差异。

122例重症肺炎患儿支气管肺泡灌洗液的病毒检测分析

目的了解湖南长沙地区重症肺炎患儿中呼吸道病毒的感染状况。方法2011年1月至2011年12月，收集重症肺炎儿童的肺泡灌洗液标本122份，采用巢氏或普通逆转录聚合酶链反应（nested-PCR或RT—PCR）对腺病毒（ADV）、博卡病毒（HBoV）及副流感病毒1、2和4（PIV1、2、3、4）、呼吸道合胞病毒（RSV）、鼻病毒（HRV）、流感病毒A、B（IFVA—B）、人偏肺病毒（HMPV）、冠状病毒HKUl及NL63（HCoV-HKU1、HCoV．NL63）进行检测。结果122份重症肺炎患儿肺泡灌洗液标本中，60份病毒阳性（49．1％），其中ADV检出率最高（40．98％，50／122），其次为RSV（7．37％，9／122），HBoV（7．37％，9／122）。2种病毒混合感染有21例，占35％（21／60），40％（20／50）的ADV阳性存在混合感染。结论2011年，腺病毒感染是长沙地区重症肺炎的重要病因，其中腺病毒的混合感染在重症肺炎中常见。

人新型干扰素κ的基因克隆、表达、纯化及其抗病毒活性的初步研究

目的制备人干扰素κ(hIFNκ)并初步研究其生物学活性。方法克隆hIFNκ的cDNA并根据大肠埃希菌的密码子偏好性人工合成了hIFNκ基因,在大肠埃希菌DH5α中高效表达、纯化后测定了rhIFNκ的多种生物学活性,包括抗病毒活性、抗细胞增殖活性、种属特异性以及NK细胞调节活性。结果成功地获得了高纯度的rhIFNκ,纯度在90%以上。利用WISHVSV系统检测rhIFNκ的抗病毒活力为2.0×106IU/mg。与rhIFNα2b的比较发现,rhIFNκ无论在抗病毒活性、细胞生长抑制,还是在促NK细胞活性方面均弱于前者。结论rhIFNκ在不同种属来源细胞上的抗病毒活性因种属来源而异,不同的病毒对rhIFNκ的敏感性是不同的。