牙龈卟啉单胞菌脂多糖对活性中性粒细胞胞外诱捕网形成的影响

目的:探讨牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)脂多糖(LPS)对活性中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成的影响及可能的调控机制。方法:采用25 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和0.3μg/mL P.gingivalis LPS刺激人中性粒细胞35 min,免疫荧光显微镜下观察活性NETs的形成,酶标法对胞外DNA定量,PCR法检测构成NETs的DNA来源。检测产生活性NETs的中性粒细胞感染P.gingivalis后胞内外的细菌数量,以明确NETs的杀菌效果;流式细胞术检测细胞产生的活性氧(ROS)水平;Western blot检测丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Raf)、丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(MEK)和细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平。结果:GM-CSF+P.gingivalis LPS可促进线粒体DNA来源的活性NETs形成和胞外DNA数量的增加(P<0.05),增强中性粒细胞对P.gingivalis的杀菌活性(P<0.05)。与阴性对照组相比,GM-CSF+P.gingivalis LPS刺激的中性粒细胞ROS和Raf、MEK、ERK磷酸化水平均明显增高(P<0.05)。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制剂DPI处理后,GM-CSF+P.gingivalis LPS组胞外DNA数量降低,ROS水平降低(P<0.01)。结论:GM-CSF+P.gingivalis LPS可能通过Raf、MEK、ERK磷酸化调控ROS生成,促进人中性粒细胞形成活性NETs,进而促进P.gingivalis的清除,调控牙周免疫炎症反应。

外周血中性粒细胞和口腔中性粒细胞免疫炎症反应的差异比较

目的:比较口腔中性粒细胞(oPMN)和外周血中性粒细胞(cPMN)免疫炎症反应的差异,探讨oPMN维持牙周健康的作用。方法:常规密度梯度离心法分离获得健康人外周静脉血来源的cPMN,离心过滤法分离获得健康人口腔含漱液来源的oPMN。采用1μg/mL牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)脂多糖(LPS)刺激,并以大肠杆菌(E.coli)LPS作为阳性对照,流式细胞术检测凋亡水平变化;Transwell实验比较白介素(IL)-8刺激前后两种细胞趋化能力的差异;ELISA检测IL-1β、IL-8和IL-10表达水平变化;流式细胞术检测两种细胞对P.gingivalis或E.coli的吞噬作用;免疫荧光实验观察中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成,Sytox Green法对胞外DNA进行定量;Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶1/2(MEK1/2)、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)和核转录因子-κB(NF-κB)P65磷酸化水平的变化。结果:两种LPS刺激后,与cPMN相比,oPMN凋亡增多(P<0.05)。IL-8刺激后,两种细胞趋化能力未见明显差异(P>0.05)。两种LPS刺激后,oPMN较cPMN的IL-1β、IL-8和IL-10表达水平更高(P<0.01)。oPMN吞噬P.gingivalis和E.coli的能力强于cPMN(P<0.05),形成的NETs更多,胞外DNA水平、MEK1/2、ERK1/2和NF-κB P65磷酸化水平均较cPMN更高(P<0.05)。结论:oPMN可能是具有过度活跃表型的中性粒细胞,其吞噬、分泌细胞因子和形成NETs的能力较cPMN增强,可能与其MEK1/2、ERK1/2和NF-κB磷酸化水平增高有关。