利用CRISPR/Cas9技术构建环指蛋白126基因敲除小鼠

目的利用CRISPR/Cas9技术,获得环指蛋白126(RNF126)基因敲除小鼠模型。方法针对C57BL/6小鼠Rnf126基因的第四外显子设计敲除引物,构建sgRNA重组表达载体。通过体外转录获得sgRNA及Cas9 mRNA,并以显微注射的方式将RNA导入到C57BL/6小鼠的受精卵中,通过胚胎移植至代孕母鼠。获得子代工程鼠后,用PCR对其进行鉴定。结果成功获得针对鼠Rnf126基因的sgRNA以及Cas9 mRNA;通过显微注射获得了82枚状态良好的受精卵并成功移植至3只代孕母鼠体内;获得了11只F0代仔鼠,鉴定后选择一只单链缺失62个碱基的阳性鼠进行扩繁并在F1、F2代检测到该突变。结论成功构建Rnf126基因敲除C57BL/6小鼠,该模型可用于RNF126基因及其表达产物的生物学功能研究。

利用CRISPR/Csa9技术构建溶酶体运输调节因子基因缺陷C57BL/6小鼠

目的获得自然杀伤(NK)细胞缺陷的小鼠动物模型,并研究溶酶体运输调节因子(Lyst)基因的功能。方法采用CRISPR/Cas9技术敲除C57BL/6小鼠的Lyst基因:针对小鼠Lyst基因编码区第50个外显子,设计CRISPR/Cas9靶点引物(sgRNA),并重组构建pUC57-Lyst-sg RNA载体。将重组质粒体与Cas9质粒分别利用T7 RNA聚合酶体外转录为mRNA,并按比例显微注射入小鼠受精卵,将受精卵移植到受体动物。获得子代小鼠后,利用PCR扩增和测序方法筛选Lyst基因发生改变的动物个体。结果显微注射移植后获得7只F0代基因敲除小鼠,且毛色均发生了明显的变化。结论利用CRISPR/Cas9技术可以构建Lyst基因缺陷小鼠,外观表型与已有的文献报道一致。